[發明專利]抗聚集人源IgG抗體CH2結構域突變體及應用

有效

• 申請號: 201711496474.X
• 申請日: 2017-12-31
• 公開（公告）號: CN108191974B
• 公開（公告）日: 2021-04-09
• 發明（設計）人: 龔睿
• 申請（專利權）人: 武漢班科生物技術股份有限公司
• 主分類號: C07K16/18
• 分類號: C07K16/18;C07K19/00
• 代理公司: 武漢河山金堂專利事務所(普通合伙) 42212
• 代理人: 胡清堂

本發明公開了一種抗聚集人源IgG抗體CH2結構域突變體及應用。本發明以IgG抗體的CH2片段為對象，在已有的改造骨架m01s的基礎上，預測易聚集區，進行進一步優化，得到新骨架m01sm1。m01sm1相對于突變體m01s，其穩定性更好，有利于開發更穩定的C?型單域抗體，可降低單克隆抗體或者Fc融合蛋白的生產、純化、保存成本，其抗聚集能力更好，可降低因為蛋白的聚集而導致臨床使用風險。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體地指一種抗聚集人源IgG抗體CH2結構域突變體及應用。

背景技術

抗體以其特異性強、靈敏度高，廣泛應用于各個領域，尤其是生命科學研究和臨床治療如ELISA、Western blot、免疫熒光分析、疾病快速診斷以及作為生物制劑治療各種疾病。因此，進入21世紀以來，人們也開始越來越關注治療性抗體藥物的研發與臨床應用，這是因為它對人體毒副作用小、具有天然和高度特異性的療效，并且創造出了巨大的社會效益和經濟效益。同時，基于CH2片段開發的小型化抗體以其分子量相對較小而具有很好的組織滲透性，可以識別全長抗體難以識別的表位。

然而，以野生型CH2片段為骨架開發的抗體存在自身局限性，如如穩定性差、抗聚集能力弱，在其表達、純化、貯存等過程中，會傾向于聚集或者降解。而蛋白聚集所導致的免疫原性，不僅降低了藥效，同時也給臨床應用帶來很大的風險。因此，提高抗體熱穩定性與抗聚集能力是該領域亟待解決的問題之一。

針對CH2的穩定性較弱的缺陷，有研究者通過引入一對二硫鍵得到一個CH2的突變體m01，相對CH2，其Tm值提高近20℃(Gong R,et al.,J Biol Chem.,2009)；通過截去CH2的N-端的七個處于無規則狀態的氨基酸，得到一個截短的突變體CH2s，相對CH2，CH2s的抗聚集能力得到顯著提高(Gong R,et al.,Mol Pharm.,2013)。將這兩者結合之后得到一個新的突變體m01s(Gong R,et al.,J Biol Chem.,2011)，它的Tm值比CH2的Tm值高30℃，具有更好的可溶表達與蛋白酶抗性。更為重要的是，相對于CH2，m01s具有更好的依賴于pH的與人FcRn的結合能力，在不同動物模型中的血漿半衰期可達10小時左右，遠遠長于與其分子量相似的其它結構域(如VH的血漿半衰期僅有幾分鐘)(Gehlsen K,et al.,MAbs,2012)。因此，m01s可以作為一個理想的骨架用于抗體庫的構建和篩選。

發明內容

本發明的目的在于提高IgG或者以CH2為骨架的小型化抗體抗聚集性，提供一種抗聚集人源IgG抗體CH2結構域突變體及應用，在已有的改造骨架m01s的基礎上，對其進行進一步優化，在保證其空間構象的同時，提高其抗聚集性。

為實現上述目的，本發明提供了一種抗聚集人源IgG抗體CH2結構域突變體，命名為m01sm1，其氨基酸序列為Seq ID No.1。

可選地，所述抗聚集人源IgG抗體CH2結構域突變體的編碼基因序列為Seq IDNo.2。

本發明還揭示了上述抗聚集人源IgG抗體CH2結構域突變體在制備Fc融合蛋白中的應用以及在制備單克隆抗體中的應用。

本發明以IgG抗體的CH2片段為對象，在已有的改造骨架m01s的基礎上，預測易聚集區，進行進一步優化，得到新骨架m01sm1。將該CH2骨架表達純化之后，對其存在形式與分子結果進行了分子篩、圓二色譜分析，通過紫外分光光度計與熒光光譜儀測定其穩定性、抗聚集能力；隨后，利用可識別CH2結構域的單抗Anti-CH2對其構象變化進行了分析，表明定向修飾改造后的CH2骨架空間構象變化后提高了其穩定性。新的CH2骨架在單克隆抗體、Fc融合蛋白或者直接以該骨架開發抗體的研發和臨床使用上具有重要意義，包括提高其穩定性后有利于降低生產、純化成本，有利于降低單抗聚集引發的免疫原性等。

本發明的有益效果：