[發明專利]谷氨酰胺合成酶基因以及應用

在審

• 申請號: 201711481610.8
• 申請日: 2017-12-29
• 公開（公告）號: CN109988777A
• 公開（公告）日: 2019-07-09
• 發明（設計）人: 時紅星;趙鈺;陳明月;祁碧玉;賀偉偉;鄒晉晉;張麗華
• 申請（專利權）人: 南京金斯瑞生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/52
• 分類號: C12N15/52;C12N9/00;C12N15/85;C12N15/66
• 代理公司: 北京華睿卓成知識產權代理事務所(普通合伙) 11436
• 代理人: 程淼

本發明提供了一種新的谷氨酰胺合成酶基因，其具有如SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列。本發明還提供了含有所述谷氨酰胺合成酶基因的真核表達載體。本發明提供的谷氨酰胺合成酶基因可用在GS基因擴增系統中促進目的蛋白的表達以及高表達細胞株的篩選。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種新的谷氨酰胺合成酶基因，以及該谷氨酰胺合成酶基因在真核表達載體構建中的應用。

背景技術

根據目的蛋白表達的時間差異以及表達過程是否需要添加篩選壓力，可將表達系統分為瞬時表達系統和穩定表達系統。瞬時表達系統是指宿主細胞在導入含有外源基因的表達載體后不添加篩選壓力，收集細胞產生的蛋白，轉染后的細胞隨著分裂而逐漸丟失目的蛋白，不能持續長久的進行蛋白生產。穩定表達系統是指表達載體進入宿主細胞并經篩選壓力選擇培養，挑選篩選后的細胞進行蛋白生產，目的基因整合進細胞基因組，并隨著細胞分裂，目的基因仍能穩定存在，可以持續長久地提供目的蛋白。由于穩定表達需經過壓力選擇甚至基因擴增等步驟，需要較長的時間且需要消耗相對多的人力。

近年，伴隨著哺乳動物細胞培養技術的發展，提高了單克隆抗體以及其他重組蛋白的表達量。穩定細胞系的構建是重組抗體產業化制備的第一步。作為抗體產業上游關鍵技術，如何快速、高效建立生產細胞系，是抗體產業發展中的關鍵問題。

外源基因在哺乳動物細胞內的擴增是提高外源基因表達水平的重要策略之一。一般來講，表達系統中的整個載體是由兩個獨立且連在一起的表達單元組成：外源基因表達單元和擴增基因表達單元。擴增基因往往亦為選擇標記。二氫葉酸還原酶 (dihydrofolatereductase，DHFR)基因擴增系統和谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase， GS)擴增系統是最常用的基因擴增選擇系統。DHFR系統是將目的基因和DHFR基因同時或分別轉染細胞后加入氨甲喋呤(methotrexate，MTX)加壓擴增。GS系統是新近發展的更有效的擴增表達系統。細胞轉染GS基因及目的基因后，谷氨酰胺合成酶利用細胞內的氨和谷氨酰胺，在缺乏外源谷氨酰胺的培養條件下，加入甲硫氨酸砜亞胺 (Methionine sulphoximine,MSX)進行擴增，達到提高目的基因表達水平的目的。與 DHFR系統相比，GS系統不需要進行繁瑣的加壓過程便可以得到高水平的表達量。

然而，現有的GS系統仍然存在表達效率不能滿足生產要求以及高表達細胞株難以篩選的問題。

發明內容

在一方面，本發明提供了一種新的谷氨酰胺合成酶基因(本文中也稱作GS16034基因)，其具有如SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列。

另一方面，本發明提供了一種真核表達載體，其含有所述谷氨酰胺合成酶基因。

在一個實施方案中，所述真核表達載體是通過將初始載體pcDNA3.1(+)位點2136-2931bp間序列替換為所述谷氨酰胺合成酶基因而得到。

在另一實施方案中，所述真核表達載體是通過以下步驟制備：

1)將初始載體pcDNA3.1(+)位點2136-2931bp間序列替換為mGS基因以獲得中間載體pcDNA3.1-mGS，其中所述mGS基因具有如SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列；

2)將初始載體pcDNA3.1(+)位點232-819bp間序列克隆進所述中間載體pcDNA3.1-mGS的1252-1253bp位點之間，以獲得載體pcDNA3.1-mGS-DGV；以及

3)將所述載體pcDNA3.1-mGS-DGV上mGS基因替換為所述谷氨酰胺合成酶基因。