[發明專利]一種免疫細胞培養基、培養方法以及用途

有效

• 申請號: 201711478873.3
• 申請日: 2017-12-29
• 公開（公告）號: CN108251369B
• 公開（公告）日: 2021-03-23
• 發明（設計）人: 馬旭;高建恩;郭昌龍
• 申請（專利權）人: 國家衛生計生委科學技術研究所
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783;C12N5/0784
• 代理公司: 北京三聚陽光知識產權代理有限公司 11250
• 代理人: 李靜

本發明公開了一種免疫細胞培養基、培養方法以及用途，免疫細胞培養基包括基礎細胞培養基、細胞因子和糖皮質激素；免疫細胞培養方法包括以下步驟，S1、采集待培養的免疫細胞并激活；S2、將激活的免疫細胞接種上述免疫細胞培養基中進行細胞培養；S3、收獲免疫細胞。細胞培養刺激液包括基礎細胞培養基和細胞因子；細胞因子包括白介素2、白介素15和/或白介素21。本發明提供的免疫細胞培養基和培養方法能夠有效地增加培養的NK細胞中CD8+NK細胞的比例。

技術領域

本發明屬于細胞培養領域，具體涉及一種免疫細胞培養基、培養方法以及用途。

背景技術

自然殺傷性細胞(natural killer cell，NK)是機體免疫細胞中非常重要的先天性免疫細胞，是機體抵抗病毒入侵、清除癌變和老化細胞的重要效應細胞，被稱作是機體抗病毒、抗腫瘤的第一道屏障。NK細胞發現于上世紀70年代，近40年來隨著對NK細胞的研究的不斷深入，確定了NK細胞為一群以細胞表面標志物CD56+CD16+CD3-的異質性細胞。研究表明，與T細胞、B細胞相比，NK細胞表面標志物的特異性是相對的。人NK細胞mIg-，部分NK細胞CD2、CD3和CD8陽性，表達IL-2受體β鏈(P75,CD122)，CD11b/CD18陽性。常用檢測NK細胞的表面標志物有CD16、CD56、CD57、CD59、CD11b、CD94和LAK-1。NK細胞可以根據其細胞表面標志的不同分成許多細胞亞群，不同細胞亞群具有不同的生物學功能。

CD8分子是細胞表面表達的糖蛋白分子，是常用的細胞分類的表面標志物之一，完整的CD8分子由α和β兩種分子組成，主要存在于T細胞表面，在流式細胞檢測中表現為強陽性，是在體內殺傷腫瘤和病毒感染細胞方面非常重要的效應T細胞。這類細胞的免疫學表型為CD8+CD3+(CD8陽性的T細胞)。

NK細胞區別于T細胞的一個重要特征為NK細胞表面標志物CD3大多為陰性，而所有T細胞的表面標志物CD3均為陽性。NK細胞在健康人外周血淋巴細胞(PBMC)中所占比例為10％-15％左右，其中有一個細胞亞群在流式細胞檢測中表現為CD8弱陽性，約占NK細胞的30％-40％左右，占外周血淋巴細胞(PBMC)的3％左右。Edward等人在1990年觀察到這一細胞亞群在體外的腫瘤殺傷實驗中表現出了較CD8陰性的NK細胞具有更強的殺傷活性。隨后的研究相繼發現這一細胞亞群不僅具有較強的腫瘤細胞殺傷活性，同時在慢性病毒感染的病人中如HIV感染者中，這一細胞亞群的數量與功能都明顯下降，顯示這一細胞亞群不僅在機體抗腫瘤方面，而且在抗病毒方面可能具有重要的作用。2005年Addison等人研究發現，CD8陽性的NK細胞通過其表面的CD8α分子之間的相互交聯，可以有效的抵抗由于激活所造成的NK細胞凋亡，同時可以提高其對腫瘤細胞的殺傷活性。

鑒于NK細胞具有的腫瘤殺傷作用，多年來NK細胞一直是過繼性免疫細胞治療的重要的效應細胞之一。2012年以來NK細胞的體外培養與擴增一直是NK細胞免疫細胞治療技術研究領域的重要課題，相繼建立了NK細胞的體外擴增與培養的方法。但有關CD8陽性的NK細胞的體外培養與擴增的方法，目前尚未見報道，現有的體外擴增方法通常是對整體的NK細胞進行體外培養和擴增，并不能保證其中的CD8陽性的NK細胞亞群能夠得到大量的擴增，如中國專利文獻CN105754941A公開的一種外周血NK細胞的體外誘導擴增培養方法，通過應用細胞因子白介素-2、白介素-15、4-1BBL和SCGM培養基聯合培養外周血單個核細胞，前期使用自體血清和白介素-2以及白介素-15、4-1BBL孵育固定在細胞培養板上誘導激活單個核細胞中的少量NK細胞快速增殖，后期采用含有自體血清的SCGM培養基以及白介素-2、白介素-15、4-1BBL培養細胞誘導NK細胞大量快速增殖。上述方案獲得了一定數量和活力的NK細胞，能夠對腫瘤細胞起到殺傷作用。然而上述方案僅能擴增NK細胞，并沒有針對其中的CD8陽性的NK細胞亞群進行培養和擴增而設計相應的培養基和方法步驟，因此上述方案無法保證對NK細胞擴增的同時對其中的CD8陽性的NK細胞亞群進行擴增，即上述方法無法在體外擴增和培養出大量的CD8陽性的NK細胞。

發明內容