[發明專利]一種在T細胞中具有高轉錄活性的嵌合啟動子

在審

• 申請號: 201711476630.6
• 申請日: 2017-12-29
• 公開（公告）號: CN109988759A
• 公開（公告）日: 2019-07-09
• 發明（設計）人: 錢其軍;金華君;王超;何周;李林芳;孫娟娟;黃晨
• 申請（專利權）人: 上海細胞治療研究院;上海細胞治療集團有限公司
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/85;C12N5/10
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司 31100
• 代理人: 韋東

1.一種增強的啟動子序列，其特征在于，所述增強的啟動子序列由增強子sDTS和與該增強子可操作地連接的啟動子組成，其中，所述增強子sDTS的序列如SEQ ID NO:1所述；所述增強子位于所述啟動子的5’端或3’端，優選位于5’端。

2.如權利要求1所述的增強的啟動子序列，其特征在于，所述啟動子選自：EF1α啟動子、PGK啟動子、β-actin啟動子、hCMV啟動子、EEF2啟動子、CAG啟動子、U6啟動子和SV40啟動子；優選地，所述啟動子為EF1α啟動子、hCMV啟動子或β-actin啟動子；更優選地，所述啟動子為EF1α啟動子；

優選地，所述EF1α啟動子的核苷酸序列可如SEQ ID NO:3所示；所述hCMV啟動子的核苷酸序列可如SEQ ID NO:4所示；所述β-actin啟動子的核苷酸序列可如SEQ ID NO:5所示。

3.一種核酸構建物，所述核苷酸構建物含有權利要求1或2所述的增強的啟動子序列；

優選地，所述核酸構建體是一表達框，從5’端到3’端依次含有可操作性連接的所述增強的啟動子序列、感興趣蛋白的編碼序列以及轉錄終止子。

4.一種載體，所述載體含有權利要求1或2所述的增強的啟動子序列。

5.如權利要求4所述的載體，其特征在于，所述載體是真核表達載體，選自：瞬時表達載體、病毒表達載體和轉座載體；

優選地，所述載體是用于將感興趣的基因的表達框整合到宿主細胞的基因組中的載體，優選是轉座載體；優選地，所述轉座載體含有選自piggybac、sleeping beauty、frogprince、Tn5或Ty的轉座元件。

6.如權利要求5所述的載體，其特征在于，在所述轉座載體的5’LTR和3’LTR之間依次含有可操作性連接的所述增強的啟動子、一個或多個限制性內切酶的酶切位點或任選的感興趣的編碼序列、以及轉錄終止序列；

優選地，在所述3’LTR的3’端還可操作性地連接有轉座酶的編碼序列及其啟動子序列；

優選地，所述載體的核酸序列如SEQ ID NO:12所示；

優選地，所述轉錄終止序列是SV40polyA轉錄終止序列。

7.如權利要求5或6所述的載體，其特征在于，

所述感興趣的基因為PD-1單鏈抗體的編碼序列；和/或

所述酶切位點選自：AscI酶切位點、XbaI酶切位點、PvuI酶切位點、EcoRI酶切位點和SalI酶切位點。

8.權利要求1或2所述的增強的啟動子序列在驅動外源基因在T細胞內的表達中的應用。

9.一種T細胞，其含有權利要求1或2所述的增強的啟動子序列或權利要求3所述的核酸構建物或權利要求4-7中任一項所述的載體；

優選地，所述T細胞的基因組中整合了以權利要求1或2所述的增強的啟動子序列作為啟動子以驅動感興趣外源基因表達的表達框。

10.一種穩定地表達抗體的T細胞，其特征在于，所述T細胞的基因組中整合了含有權利要求1或2所述的增強的啟動子序列及與該啟動子序列可操作性連接的抗體的編碼序列的表達框；

優選地，所述抗體選自：PD-1抗體，PD-L1抗體，CTLA4抗體，CD40抗體，CD40L抗體，CD47抗體，CD137抗體，CD28抗體，CD27抗體，OX40抗體，DNAM-1抗體，GITR抗體，ICSOS抗體，2B4抗體，CD160抗體，TIM3抗體，LAG3抗體，BTLA抗體和TIGIT抗體；

更優選地，所述抗體為PD-1抗體；優選地，所述PD-1抗體的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示，其編碼序列優選如SEQ ID NO:11所示。