[發明專利]一種從痰液中快速提取核酸的方法

有效

• 申請號: 201711475154.6
• 申請日: 2017-12-29
• 公開（公告）號: CN107904232B
• 公開（公告）日: 2020-10-16
• 發明（設計）人: 陳燃;宣金聰;曹文靜
• 申請（專利權）人: 浙江今復康生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 杭州裕陽聯合專利代理有限公司 33289
• 代理人: 姚宇吉

本發明提供了一種從痰液中快速提取核酸試劑及方法，所述試劑包括前處理液和核酸抽提劑，其中前處理液包括以下成分：1?5mM 2?(N?嗎啡啉)乙磺酸，1?5mM乙酸鈉或1?20mg/ml蛋白酶K，5?15％β?巰基乙醇，3?7M鹽酸胍，0.01?0.1％Triton；核酸抽提劑為氯仿、水飽和酚、異丙醇的一種或多種。本發明該方法將鹽酸胍和氯仿結合同時用于痰液處理及核酸抽提，僅需少量試劑即可完成痰液液化和滅活核酸酶，最大程度地降低核酸的降解和損失。該方法不僅能夠一步法完成痰液液化、細胞裂解以及核酸抽提過程，簡化核酸提取步驟，節省操作時間，還能有效降低核酸的降解和損失，提高痰液核酸的提取效率。

技術領域

本方法屬于用于醫學檢測的樣本核酸提取技術領域，涉及一種從痰液中快速提取核酸的方法，技術關鍵在于一步法完成痰液液化、細胞裂解以及核酸抽提過程。

背景技術

痰是人體呼吸道的分泌物，它是通過支氣管纖毛運動，從肺部向上呼吸道推動，最后通過人的正?？人苑瓷鋸臍夤軆瓤瘸雠懦鲶w外。當人吸入刺激性氣體、塵埃、致病細菌、病毒等有害微生物時，上呼吸道就可能發生炎癥；或者肺部發生疾病，如支氣管擴張、肺膿腫、肺癌等，呼吸道就會分泌增加，痰量就會增加，而痰的性質也會發生變化，可以由粘痰變成干酪痰、血痰、黃膿痰等。根據痰液產生和排出機制可知，痰液中包含多種病原微生物、各類炎癥細胞、脫落壞死的黏膜上皮細胞以及腫瘤細胞等。通過檢測痰液樣本中病原體的核酸來鑒定病原體的種類是目前最精準且最快速的呼吸道病原體診斷方法?？梢鸺毙院粑栏腥镜牟≡w中，病毒占主要地位，其次才是細菌、支原體、霉菌、原蟲等。在原發的急性上呼吸道感染中，病毒感染高達90％以上。常見的呼吸道病原體有：結核分枝桿菌、呼吸道合胞病毒、腺病毒、EB病毒、流感病毒、肺炎支原體、風疹病毒、鏈球菌、葡萄球菌、肺炎衣原體、細小病毒B19、巨細胞病毒以及冠狀病毒等。傳統的病原體診斷方法是分離培養或者血清學檢測，分離培養耗時長、操作復雜，不適用于臨床急癥的診斷；血清學檢測很難在疾病做到早期診斷。隨著熒光定量PCR以及多重PCR技術在病原體檢測領域的快速發展，具有特異性強、靈敏度高、操作簡便、檢測迅速、檢出率高等特點，該技術已逐漸在臨床診斷領域占據重要地位。此外，從肺癌高危人群及肺癌患者的痰液樣本中提取核酸，可用于早期肺癌的預測以及肺癌患者的基因突變檢測和治療監測。綜上，痰液樣本中核酸檢測在臨床上具有重要意義。

由于痰液樣本具有粘度大、蛋白多、不易液化、易成團等特點，痰液樣本的核酸檢測常規至少需要經歷3步前處理過程：痰液液化、細胞裂解以及核酸抽提。常規前處理過程主要存在以下不足：(1)單獨的痰液液化過程由于要求保存細胞的完整性而不添加強變性劑，故極易造成樣本中的RNA被RNA酶催化降解，從而導致樣本核酸損失。(2)常規的痰液液化常用巰基類試劑，且加入的試劑體積多為5-10倍痰液體積，導致最終的樣品體積較大，從而極易發生核酸降解和損失；(3)操作過程較為復雜耗時；分別為氫氧化鈉法、DTT(二硫蘇糖醇)法以及蛋白酶法。氫氧化鈉法是最常用的痰液液化方法，該方法比較簡單，利用主成分為一定濃度的氫氧化鈉溶液在60-80℃(也可在室溫條件下)液化痰液，該方法用于核酸檢測時其強堿性環境易造成核酸損失。DTT(二硫蘇糖醇)法的原來是利用含巰基(-SH)的DTT(二硫蘇糖醇)斷裂痰液中導致粘稠的主要成分粘蛋白，以PBS緩沖液(磷酸鹽緩沖液)提供生理緩沖，通常還會加入乙醇等固定細胞。該方法使用的DTT(二硫蘇糖醇)成本較高，且該方法易造成RNA損失，不適合大批量處理臨床痰液樣本。蛋白酶法的原理是利用蛋白酶消化痰液黏蛋白，該方法的酶解反應耗時較長，所需蛋白酶成本較高，且黏蛋白消化效率低。

目前已公開的相似發明專利：中國專利申請文件CN104263721A公開的《一種保護痰液中核酸(DNA和RNA)的痰紙及核酸提取方法》以及中國專利申請文件CN106065400A公開的《一種從痰液中提取核酸的試劑盒及提取方法》，主要存在以下不足：(1)加入的痰液處理試劑較多且痰液處理步驟較多，易造成核酸損失；(2)操作步驟多且較為繁瑣，操作耗時；(3)使用的試劑種類較多，核酸提取成本高。此外，目前已公開的用于提取組織或細胞樣本中核酸的發明專利較多，但是這些專利技術由于不含痰液液化過程，因此無法處理痰液樣本。