[發(fā)明專利]一種鈣質(zhì)砂中產(chǎn)脲酶細菌的高效分離與鑒定方法

在審

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• 申請日: 2017-12-29
• 公開（公告）號: CN108085279A
• 公開（公告）日: 2018-05-29
• 發(fā)明（設計）人: 肖楊;汪楊;劉漢龍;楊陽;何想;肖鵬;陳輝
• 申請（專利權(quán)）人: 重慶大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N1/02;C12Q1/04;C12R1/07
• 代理公司: 重慶大學專利中心 50201
• 代理人: 王翔

本發(fā)明公開了一種鈣質(zhì)砂中產(chǎn)脲酶細菌的高效分離與鑒定方法，其特征在于，主要包括以下步驟：產(chǎn)脲酶細菌的富集；分離純化產(chǎn)脲酶細菌；產(chǎn)脲酶細菌的鑒定；產(chǎn)脲酶細菌的脲酶酶活力檢測。鈣質(zhì)砂巖土介質(zhì)上進行加固施工過程中，水泥等土木工程材料的大量使用，會對自然環(huán)境造成的長久不利影響，本發(fā)明提供了一種鈣質(zhì)砂中產(chǎn)脲細菌的高效分離與鑒定方法，為微生物加固鈣質(zhì)砂提供細菌材料，為MICP技術(shù)奠定了基礎(chǔ)，能最大限度減少巖土加固施工過程中對環(huán)境的影響。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及微生物生態(tài)學與巖土工程技術(shù)交叉領(lǐng)域，具體是一種鈣質(zhì)砂中產(chǎn)脲酶細菌的高效分離與鑒定方法。

背景技術(shù)

鈣質(zhì)砂(又稱珊瑚礁砂)是巖土工程技術(shù)領(lǐng)域一種特殊的巖土介質(zhì)。鈣質(zhì)砂顆粒中，粒徑大于2mm的顆粒所占比例較低，主要有兩種類型，一種為膠結(jié)的礁灰?guī)r碎塊，另一種為珊瑚斷枝。由于珊瑚礁砂其的生物成因且形成過程中多未經(jīng)長途搬運，保留了原生生物骨架中的細小孔隙等原因，形成的土顆粒多孔隙(含有內(nèi)孔隙)、形狀不規(guī)則、易破碎、顆粒易膠結(jié)等，使得其工程力學性質(zhì)與一般陸相、海相沉積物相比有較明顯的差異且隨著沉積歷史、地理區(qū)域而變化。

微生物加固土作為近年來環(huán)境巖土較新的研究領(lǐng)域，其核心技術(shù)即為MICP(Microbially Induced Calcite Precipitation，微生物誘導碳酸鈣沉淀)，通過微生物作用，以一種綠色環(huán)保的方式，分解尿素，在土體顆粒之間形成碳酸鈣沉淀，從而達到土體固化，提高土體剛度和強度。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，提供一種鈣質(zhì)砂中產(chǎn)脲酶細菌的高效分離與鑒定方法。

為實現(xiàn)本發(fā)明目的而采用的技術(shù)方案是這樣的，一種鈣質(zhì)砂中產(chǎn)脲酶細菌的高效分離與鑒定方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)產(chǎn)脲酶細菌的富集

1.1)采集原位沙灘鈣質(zhì)砂樣品，將取得的土樣去除雜質(zhì)、篩分處理，控制粒徑小于0.85mm；按每份10g～20g分裝于干凈的試管中，貯藏于4℃環(huán)境；

1.2)取步驟1.1)中貯藏時間不超過15天的新鮮鈣質(zhì)砂加入裝有富集培養(yǎng)液的試管中，置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)；

所述恒溫振蕩培養(yǎng)箱的溫度范圍為25～35℃；

所述培養(yǎng)時間范圍為14天；

所述鈣質(zhì)砂與富集培養(yǎng)液的重量體積比(g︰mL)范圍為1︰100～1︰200；

1.3)將步驟1.2)中得到的培養(yǎng)液，加入到濃度為1.1mol/L的尿素溶液中，得到混合物A；使用電導率測試儀測定混合物A的電導率；

所述培養(yǎng)液與尿素溶液的體積比為1︰9；

當混合物A的電導率平均5分鐘變化大于0.1ms/cm時，則表示產(chǎn)脲酶細菌的存在；

所述有產(chǎn)脲酶細菌存在的混合物A為產(chǎn)物A；

2)分離純化產(chǎn)脲酶細菌

2.1)取步驟1.3)中得到的產(chǎn)物A體積15～20ml涂布到分離培養(yǎng)基平板上，置于培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)；

所述培養(yǎng)箱的溫度范圍為30℃；

所述培養(yǎng)時間范圍為15天；

2.2)觀察步驟2.1)中得到的產(chǎn)物B的菌落生長情況，挑取圓形黃色的單菌落劃線到BUG+B鑒定培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)；

3)產(chǎn)脲酶細菌的鑒定

3.1)使用接種環(huán)挑取步驟2.2)中的單菌落到鑒定培養(yǎng)液GN/GP-IF(革蘭氏陰性陽性菌接種液)管壁上，并用接種環(huán)將細菌打散，使細菌與鑒定液混合，至比濁計上混濁度在90～95％之間；