[發明專利]一種鎖核酸修飾的探針以及一種測定CAR拷貝數的方法

在審

• 申請號: 201711459645.1
• 申請日: 2017-12-28
• 公開（公告）號: CN109971835A
• 公開（公告）日: 2019-07-05
• 發明（設計）人: 錢其軍;金華君;郝方元;王超;孫娟娟
• 申請（專利權）人: 上海細胞治療研究院;上海細胞治療集團有限公司
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851;C12N15/11
• 代理公司: 中國國際貿易促進委員會專利商標事務所 11038
• 代理人: 劉海羅

本發明屬于生物技術領域，涉及一種鎖核酸修飾的探針以及一種測定CAR拷貝數的方法以及引物對。具體地，本發明涉及用于所述方法的引物對，其選自如下的2個引物對中的任意一個或兩個：引物對1，SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物對；和引物對2，SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的引物對。本發明為CAR?T免疫細胞治療的質量控制和療效監測提供了更準確的技術支持，并具有較高的準確度和靈敏度。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及一種鎖核酸修飾的探針以及一種測定CAR拷貝數的方法。具體地，本發明涉及使用LNA-TaqMan探針測定含CD28-CD3zeta和CD137-CD3zeta信號區的第二代CAR或第三代CAR的拷貝數的方法。

背景技術

嵌合抗原受體T細胞(Chimeric Antigen Receptor T-Cell，CAR-T)免疫療法是目前腫瘤免疫治療中最有希望治愈腫瘤的方法之一。2017年8月和10月，美國FDA先后批準了諾華公司的CAR-T療法Kymriah(曾用名CTL-019)和Kite Pharma公司的CAR-T療法Yescarta(axicabtagene ciloleucel)上市，分別用于治療兒童、年輕成年患者急性淋巴細胞性白血病和罹患特定類型的大B細胞淋巴瘤。CAR-T藥物的上市，表明監管部門對CAR-T的臨床療效和臨床安全性的認可。CAR-T在血液瘤的極大成功對CAR-T療法的應用產生了巨大的推動作用。目前CAR-T療法的應用已經不局限于血液腫瘤的治療。

CAR-T的制備與質控是影響CAR-T治療安全性和治療效果的關鍵因素之一。CD28和CD137是兩種T細胞共刺激分子，對T細胞的活化、增殖有重要作用，是第二代CAR和第三代CAR的重要組成部分之一。

實時熒光定量PCR是在DNA擴增反應中加入熒光基團，利用熒光信號積累，實時監測PCR產物量的變化。實時熒光定量PCR因其靈敏度高、重復性好、操作簡單、成本低廉等特點，在檢測領域廣泛使用。利用實時熒光定量PCR的方法，可以從分子水平對CAR-T中的CAR進行拷貝數檢測，為CAR-T的臨床質控和臨床治療的體外監測提供技術支持。

目前，尚需要開發新的熒光定量PCR測定CAR拷貝數的方法和相關產品。

發明內容

本發明人經過深入的研究和創造性的勞動，得到了一種引物對和探針。在此基礎上，本發明人得到了熒光定量PCR測定CAR拷貝數的方法和試劑盒。本發明的方法或試劑盒能夠測定制備的CAR-T中CAR的拷貝數，或CAR-T治療患者的外周血細胞中CAR的拷貝數，用于控制CAR-T的質量、評估CAR的轉導效率或臨床治療的體外監控。由此提供了下述發明：

本發明的一個方面涉及一種引物對或引物對的組合，其選自如下的2個引物對中的任意一個或兩個：

引物對1，SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物對；和

引物對2，SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的引物對。

本發明的另一方面涉及一種探針或探針組合，其選自如下的2個探針的中的任意一個或兩個：

探針A，其核酸序列如SEQ ID NO:3所示；和

探針B，其核酸序列如SEQ ID NO:6所示。

在本發明的一個或多個實施方案中，所述探針的5’端標記有熒光報告基團，3’端標記有熒光淬滅基團；優選地，所述熒光報告基團選自FAM、Hex、VIC、ROX和Cy5；優選地，所述熒光淬滅基團選自BHQ1、TAMRA、JOE、BHQ2和BHQ3。

FAM的結構式以及連接方式如下面的式I所示。

BHQ1的結構式以及連接方式如下面的式II所示。