[發明專利]一種鎖核酸修飾的探針以及一種測定CAR拷貝數的方法

在審

• 申請號: 201711459645.1
• 申請日: 2017-12-28
• 公開（公告）號: CN109971835A
• 公開（公告）日: 2019-07-05
• 發明（設計）人: 錢其軍;金華君;郝方元;王超;孫娟娟
• 申請（專利權）人: 上海細胞治療研究院;上海細胞治療集團有限公司
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851;C12N15/11
• 代理公司: 中國國際貿易促進委員會專利商標事務所 11038
• 代理人: 劉海羅

1.引物對，其選自如下的2個引物對中的任意一個或兩個：

引物對1，SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物對；和

引物對2，SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的引物對。

2.探針，其選自如下的2個探針的中的任意一個或兩個：

探針A，其核酸序列如SEQ ID NO:3所示；和

探針B，其核酸序列如SEQ ID NO:6所示。

3.根據權利要求2所述的探針，其中，所述探針的5’端標記有熒光報告基團，3’端標記有熒光淬滅基團；

優選地，所述熒光報告基團選自FAM、Hex、VIC、ROX和Cy5；

優選地，所述熒光淬滅基團選自BHQ1、TAMRA、JOE、BHQ2和BHQ3。

4.根據權利要求2或3所述的探針，其中，

探針A和/或探針B中的一個或多個位置的堿基被鎖核酸修飾。

5.根據權利要求4所述的探針，其中，

探針A的5’端起第4位、第7位、第10位和第13位中的任意1個、2個、3個或4個堿基被鎖核酸修飾；

和/或，

探針B的5’端起第4位、第7位、第10位和第13位中的任意1個、2個、3個或4個堿基被鎖核酸修飾。

6.一種試劑盒，其包含權利要求1所述的引物對，和/或權利要求2至5中任一權利要求所述的探針。

7.根據權利要求6所述的試劑盒，其包含：

引物對1和探針A；

和/或

引物對2和探針B；

優選地，所述試劑盒還包含PCR反應所需的試劑，例如Mg²⁺、反應緩沖液、dNTP和Taq酶。

8.一種測定CAR拷貝數的方法，包括如下步驟：

(1)提取待測樣品的DNA；

(2)使用含CD28-CD3zeta信號區或含CD137-CD3zeta信號區的CAR質粒作為標準品母液，制成標準品系列；

(3)使用權利要求1所述的引物對和權利要求2至5中任一權利要求所述的探針，對標準品系列和樣品的DNA進行實時熒光定量PCR檢測；

(4)根據每個標準品的Ct值及其對應的拷貝數，分別繪制CD28-CD3zeta基因和CD137-CD3zeta基因的標準曲線；將檢測樣本的DNA的Ct值代入對應的標準曲線，得到待測樣品的CAR基因拷貝數；

優選地，步驟(1)中的待測樣品為CAR質粒轉導過的CAR-T或CAR-T回輸患者的外周血；

優選地，步驟(2)中的梯度稀釋為10倍梯度稀釋；

優選地，步驟(3)中所述實時熒光定量PCR的擴增反應的條件為：94℃5min；94℃20s，60℃1min，共40個循環。

9.一種對CAR-T進行質量控制的方法，包括下述步驟：

A.測定CAR拷貝數，

B.與免疫治療要求的CAR拷貝數進行比較；

其中，步驟A中所述測定CAR拷貝數采用權利要求8中所述的測定CAR拷貝數的方法。

10.權利要求1所述的引物對和/或權利要求2至5中任一權利要求所述的探針在制備用于測定CAR拷貝數的藥物或者制備用于對CAR-T進行質量控制的藥物中的用途。