[發明專利]一種源于光敏色素的黃色熒光標記物的制備方法

在審

• 申請號: 201711458455.8
• 申請日: 2017-12-28
• 公開（公告）號: CN108164604A
• 公開（公告）日: 2018-06-15
• 發明（設計）人: 吳明;盧艷華;陳彥蓉;夏坤;佟順剛
• 申請（專利權）人: 廣州天寶頌原生物科技開發有限公司
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;C12N15/70
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205
• 代理人: 許飛

本發明公開了一種源于光敏色素的黃色熒光標記物的制備方法，融合蛋白包括藍細菌光敏色素蛋白slr1393的第3個GAF結構域和鏈霉親和素。本發明的融合蛋白序列，易于在微生物中穩定表達，規避了高純度天然藻膽蛋白和藍細菌光敏色素的獲取困難，制備成本較高；化學修飾劑的使用；天然藻膽蛋白聚合形態不穩定等缺點。本發明的表達方法，無需藻膽蛋白裂合酶參與，減少轉化的基因數量，提高菌種穩定性和篩選效率。同時通過優化發酵培養基和發酵條件，大大提高了融合蛋白的產量。

技術領域

本發明涉及融合蛋白表達領域，特別涉及一種光敏色素熒光標記物的制備方法。

背景技術

熒光探針(或熒光標記物)是熒光免疫檢測技術的重要基礎原料，主要是通過化學修飾法，將熒光底物同生物素-鏈霉親和素系統結合得到，可進一步放大熒光信號，提高免疫檢測的靈敏度。

天然藻膽蛋白是最常見的熒光底物之一，其天然結構一般為六聚體，亞基由脫輔基蛋白和藻膽色素，通過裂合酶催化結合而成。藻膽色素則由血紅素經過血紅素氧化酶(HO1)和各種膽綠素還原酶催化形成，常見的藻膽色素有藻紅膽素(PEB)，藻尿膽素(PUB)，藻藍膽素(PCB)和藻紫膽素(PVB)。通過結合不同的藻膽色素，藻膽蛋白吸收400nm～700nm范圍內不同波段的光后，可發出不同的熒光。

傳統的藻膽蛋白熒光探針制備流程，首先是獲取高純度天然藻膽蛋白，然后通過化學修飾法，與生物素-鏈霉親和素系統結合，進一步純化后再用于免疫檢測。但是高純度的天然藻膽蛋白獲取困難，制備成本高，同時結構不穩定，聚合形態多變。這使得藻膽蛋白熒光探針的成本居高不下。

通過微生物表達融合蛋白是一種成本較低的蛋白制備方法。然而融合蛋白的表達往往受到融合基因的設計和發酵工藝的限制，并不能穩定的表達，難以得到質量穩定的合格產品。

如何選擇合適的蛋白片斷進行融合，使其可以更為穩定地發酵生產，是有待解決的技術問題。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供一種易于表達的融合蛋白序列及其表達方法。

本發明所采取的技術方案是：

一種融合蛋白，其包括藍細菌光敏色素蛋白slr1393的第3個GAF結構域和鏈霉親和素。

作為上述融合蛋白的進一步改進，融合蛋白中還添加有親和標記。

作為上述融合蛋白的進一步改進，融合蛋白的序列為：MGSSHHHHHHSQDPEAGITGTWYNQLGSTFIVTAGADGALTGTYESAVGNAESRYVLTGRYDSAPATDGSGTALGWTVAWKNNYRNAHSATTWSGQYVGGAEARINTQWLLTSGTTEANAWKSTLVGHDTFTKVKPSAASGSGTDDDDKAMADGLQNIFRATSDEVRHLLSCDRVLVYRFNPDWSGEFIHESVAQMWEPLKDLQNNFPLWQDTYLQENEGGRYRNHESLAVGDVETAGFTDCHLDNLRRFEIRAFLTVPVFVGEQLWGLLGAYQNGAPRHWQAREIHLLHQIANQLGVAVYQAQLLARFQE。

表達上述融合蛋白的核苷酸序列。進一步的，核苷酸序列根據宿主菌進行密碼子優化。

插入有上述核苷酸序列的質粒。

作為上述質粒的進一步改進，質粒為pET Duet載體質粒，核苷酸序列通過酶切位點BamHⅠ、EcoRⅠ插入pET Duet載體質粒的多克隆位點1。

一種融合蛋白的制備方法，包括如下步驟：

1)根據上融合蛋白的序列，設計得到融合蛋白基因序列；

2)將融合蛋白基因序列插入到質粒中，得到融合蛋白質粒；