[發明專利]特異性靶向CD19抗原且高水平穩定表達PD-1抗體的CAR-T細胞及用途

有效

• 申請號: 201711457252.7
• 申請日: 2017-12-28
• 公開（公告）號: CN109971712B
• 公開（公告）日: 2023-06-20
• 發明（設計）人: 錢其軍;金華君;何周;劉祥箴;李林芳;崔連振
• 申請（專利權）人: 上海細胞治療研究院;上海細胞治療集團有限公司
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/13;C12N15/62;C12N15/63;C07K19/00;C07K16/28;A61K39/395;A61P35/00;A61P35/02
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司 31100
• 代理人: 韋東

本發明涉及特異性靶向CD19抗原且高水平穩定表達PD?1抗體的CAR?T細胞及用途。具體而言，本發明的T細胞含有表達識別CD19抗原的嵌合抗原受體的編碼序列和PD?1抗體的編碼序列；和/或表達識別CD19抗原的嵌合抗原受體和PD?1抗體。本發明的T細胞能克服免疫微環境抑制，促進腫瘤細胞的凋亡，發揮抗腫瘤的免疫反應，可用于多種類型惡性腫瘤的治療。

技術領域

本發明涉及特異性靶向CD19抗原且高水平穩定表達抗PD-1抗體的CAR?T細胞及其抗腫瘤效果。

背景技術

嵌合抗原受體T細胞(chimeric?antigen?receptor?T?cell,CAR-T)治療技術無疑是腫瘤免疫細胞治療領域中一顆冉冉升起的巨星。CAR-T技術是通過基因工程技術將識別某抗原分子的抗體可變區基因序列與T淋巴細胞免疫受體的胞內區序列拼接后，通過逆轉錄病毒或慢病毒載體、轉座子或轉座酶系統或直接mRNA轉導到淋巴細胞內，并表達融合蛋白于細胞表面，使T淋巴細胞能通過非MHC限制性的方式識別特定抗原，增強其識別和殺傷腫瘤的能力。

CAR的結構自1989年以色列Eshhar研究小組首次提出后，經過近30年的發展，已經被證實經過CAR結構修飾的T細胞在腫瘤免疫治療中具有較好的療效。第一代CAR受體包含了胞外特異識別腫瘤抗原的片段(single-chain?variable?fragment，scFv)，胞內激活信號由CD3ζ信號鏈來傳遞。但是第一代CAR受體缺乏T細胞的共刺激信號，導致T細胞只能發揮瞬間效應，在體內存在時間短、細胞因子分泌少。第二代CAR受體增加了共刺激信號分子的胞內結構域，包括如CD28，CD134/OX40，CD137/4-1BB，lymphocyte-specific?proteintyrosine?kinase(LCK)，inducible?T-cell?co-stimulator(ICOS)以及DNAX-activationprotein?10(DAP10)等結構域，增強了T細胞的增殖能力及細胞因子的分泌功能，IL-2、IFN-γ以及GM-CSF增加，從而突破腫瘤微環境的免疫抑制、延長AICD(activation?inducedcell?death,AICD)。第三代CAR受體則是在共刺激結構CD28和ITAM信號鏈的之間再融合一個二級共刺激分子如4-1BB，因而產生了一個三重信號的CAR受體，第三代CAR受體改造的T細胞具有更好的效應功能和體內存活時間。常用的經典CAR-T結構即為二代CAR受體，其結構具體可分為以下4部分：識別腫瘤抗原的抗體單鏈可變區(scFv)、鉸鏈區、跨膜區、胞內刺激信號結構區域。CAR結構鉸鏈區負責形成正確構象，形成二聚體。鉸鏈區的長短及氨基酸序列特征，決定了CAR的空間構象，也決定了其與腫瘤細胞表面抗原結合的能力。

惡性淋巴瘤分為霍奇金淋巴瘤(HL)和非霍奇金淋巴瘤(NHL)兩大類。霍奇金淋巴瘤占淋巴瘤的10％-15％，而非霍奇金淋巴瘤是發病患者增加最快的惡性腫瘤。據WHO統計，目前全球每年約有35萬新發NHL，死亡人數超過20萬。在霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤兩大類中均可見B細胞淋巴瘤。目前淋巴瘤臨床治療藥物包括糖皮質激素和烷化劑等細胞毒藥物及基于特定分子靶標的靶向藥物(如利妥昔單抗等)，其中基于靶向藥物的聯合化療顯著提高部分淋巴瘤患者臨床緩解率和治愈率。但目前仍有相當一部分淋巴瘤患者對現有治療方案不敏感或療效欠佳而成為“真正”難治性患者。一些新型治療手段(如細胞免疫治療等)使部分復發或難治性淋巴瘤患者獲得緩解并延長其生存期。目前正在開發的針對血液系統惡性腫瘤的CAR-T的種類很多，主要包括利用抗CD19、抗CD20、抗Kappa輕鏈、抗CD22、抗CD23、抗CD30、抗CD70等抗體構建CAR修飾的T細胞進行抗腫瘤研究，其中以抗CD19、抗CD20單克隆抗體最為熱門。

選擇合適的腫瘤抗原作為靶標是設計安全有效CAR-T的關鍵。由于CD19僅表達于各分化階段的正常及惡性B細胞而不表達于其他非B細胞(如造血干細胞等)表面，是治療B系腫瘤很有潛力的靶點，也是CAR-T研究中的熱點，因而CD19CAR-T被廣泛用于急性B淋巴細胞白血病(B-ALL)、慢性B淋巴細胞白血病(B-CLL)、套細胞淋巴瘤(MCL)、NHL和多發性骨髓瘤(MM)等惡性B細胞淋巴瘤的臨床試驗。