[發明專利]一種抗人神經生長因子scFv抗體及制備方法有效
| 申請號： | 201711452295.6 | 申請日： | 2017-12-28 |
| 公開（公告）號： | CN108059676B | 公開（公告）日： | 2020-07-31 |
| 發明（設計）人： | 張文宇;鄒有土;阮卡;馬燕玲;王明灶;陳星;章永壘;葛平輝 | 申請（專利權）人： | 未名生物醫藥有限公司 |
| 主分類號： | C07K16/22 | 分類號： | C07K16/22;C12N15/13;C12N15/81;C12N1/19;C12R1/84 |
| 代理公司： | 廈門市精誠新創知識產權代理有限公司 35218 | 代理人： | 秦華 |
| 地址： | 361000 福建省廈*** | 國省代碼： | 福建;35 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 神經 生長因子 scfv 抗體 制備 方法 | ||
本發明公開了一種抗人神經生長因子scFv抗體及制備方法。其至少具有如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的重鏈可變區、如SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的輕鏈可變區和位于兩者之間的連接肽。按照本發明的制備方法可獲得純度大于90％的抗人神經生長因子scFv抗體。該方法成本低廉，具有廣闊的市場前景。制備獲得的抗人神經生長因子scFv抗體經體外細胞生物學活性檢測，具備高效的與人神經生長因子的結合能力(IC50為123ng/ml)。
技術領域
本發明涉及抗體領域，尤其涉及一種抗人神經生長因子scFv抗體及制備方法。
背景技術
抗人神經生長因子抗體可以阻斷神經生長因子介導的疼痛傳遞通路，從而在神經性疼痛、骨折疼痛、骨關節炎、類風濕關節炎、痛風關節痛等疼痛性疾病方面具有廣泛的治療作用。抗人神經生長因子完整的抗體作為復雜的真核蛋白，其分子量高達150kD，糖基化修飾復雜，僅適合在CHO等哺乳動物細胞中表達，且表達量低。
發明內容
本發明的目的在于提供一種抗人神經生長因子scFv抗體序列，同時還提供該抗體的高效表達方法。
為實現上述目的，本發明提供一種抗人神經生長因子scFv抗體，其特征在于，其至少具有如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的重鏈可變區、如SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的輕鏈可變區和位于兩者之間的連接肽。
進一步，所述重鏈可變區的DNA序列為SEQ ID NO:2所示；
任選的，所述輕鏈可變區的DNA序列為SEQ ID NO:4所示。
進一步，所述連接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；優選的，所述連接肽的DNA序列如SEQ ID NO:6所示。
進一步，所述抗人神經生長因子scFv抗體的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。
進一步，所述抗人神經生長因子scFv抗體的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。
本發明還提供所述抗人神經生長因子scFv抗體的表達載體。
進一步，所述表達載體為酵母表達載體。
本發明還提供所述表達載體的宿主細胞。
本發明還提供一種所述抗人神經生長因子scFv抗體的制備方法，其特征在于，包括如下入步驟：
構建：構建SEQ ID NO:8序列，同時，在SEQ ID NO:6的5’端引入EcoRI酶切識別位點序列GAATTC，3’端引入NotI酶切識別位點GCGGCCGC，同時下游3’端帶有終止密碼子；最終構建得到SEQ ID NO:9序列；
酶切：分別雙酶切SEQ ID NO:9和載體pPIC9K，并回收目的條帶；
連接，轉化并表達：連接上述酶切后的產物后轉入畢赤酵母GS115，并誘導抗人神經生長因子scFv抗體的表達；
親和層析純化：將上述所得通過Protein L親和層析得到抗人神經生長因子scFv抗體。
進一步，所述構建SEQ ID NO:8序列為：
將三個已有的抗人神經生長因子重鏈與輕鏈的CDR區氨基酸序列分別整合進入人抗體的重鏈與輕鏈的scFV氨基酸骨架序列，并逆翻譯成適于畢赤酵母表達的DNA序列，形成三個重鏈DNA序列模板和三個輕鏈DNA序列模板；
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