[發明專利]一種體外蛋白合成體系、試劑盒及其制備方法

在審

• 申請號: 201711452033.X
• 申請日: 2017-12-28
• 公開（公告）號: CN109971783A
• 公開（公告）日: 2019-07-05
• 發明（設計）人: 郭敏;徐開;陳鑒冰;周子鑒;柴智;章小鈴;王海鵬;于雪
• 申請（專利權）人: 康碼（上海）生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81;C12N15/85
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明提供了一種體外蛋白合成體系、試劑盒及其制備方法，具體地，本發明由特定比例的(a)細胞提取物；和(b)第一反應促進劑混合所形成的無細胞的體外蛋白合成體系可顯著提高外源蛋白的合成效率。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體地，本發明涉及一種體外蛋白合成體系、試劑盒及其制備方法。

背景技術

生物反應即生物化學反應，就是指在生物體內進行的化學反應，這些反應都由酶催化，酶和反應物溶于內環境的水中，才能發生反應，水為體內物質提供載體和介質[1]。在20世紀的最后幾十年里，生物化學在解釋生命過程方面已經取得了非常大的成就，現在幾乎植物學，醫學，遺傳學等生命科學相關的領域都有從事生物化學研究[2]。

傳統的蛋白表達系統是指通過模式生物細菌、真菌、植物細胞或動物細胞等表達外源基因的一種多步級聯生物化學反應術[3-4]。隨著科學技術的發展，無細胞表達體系也稱為體外蛋白合成系統應運而生，其是以外源目的mRNA或DNA為蛋白質合成模板，通過人工控制補加蛋白質合成所需的底物和轉錄、翻譯相關蛋白因子等物質，能實現目的蛋白質的合成[5-7]。體外翻譯系統中表達蛋白質無需進行質粒構建、轉化、細胞培養、細胞收集和破碎步驟，是一種快速、省時、便捷的蛋白質表達方式[8]。隨著科學技術的發展，蛋白合成體系已經開始得到廣泛應用。

在生物體或細胞中所進行的生物化學反應，在復雜的網絡體系中都可以通過正、負反饋得到自動調控，并且在生物體中所進行的生物化學反應都是遠離平衡點的反應，它需要從外界獲取能量或向外界輸出物質、能量和熵[9]。在細胞內，生物反應的副產物去除主要是靠機體新陳代謝、機體穩態的維持、生物酶的催化作用以及細胞內遠離平衡點的氧化還原反應達到，但這些生化反應在體外生物技術是難以實現的[10]。另外，蛋白合成體系存在的一個缺點是產量不高，反應不夠快速、靈敏，體外生物合成體系中，比如體外蛋白質合成，體外轉錄，激酶反應，ATPase反應，離子泵反應等的副產物如自由磷酸根離子、焦磷酸離子(PPi),都會限制目標產物的產量。

目前已知有其他去除反應副產物的方法如通過半透膜允許小分子在反應混合物和透析液之間被動擴散的方法進行半連續反應來控制副產物如自由磷酸根離子。但存在著半透膜透析裝置成本高，反應體系不能進行擴大化，反應產物容易堵塞半透膜孔的缺陷。

因此，本領域迫切需要開發并建立一種能夠在蛋白合成體系中，通過原位去除(insitu removal)的方式在蛋白合成體系中控制自由磷酸根離子含量來提高蛋白合成效率的方法。

發明內容

本發明的目的在于提供一種能夠在蛋白合成體系中，通過原位去除(in situremoval)的方式在蛋白合成體系中控制自由磷酸根離子含量來提高蛋白合成效率的方法。

本發明第一方面提供了一種體外蛋白合成體系，包括：

(a)細胞或細胞提取物、或其組合；

(b)第一反應促進劑，所述第一反應促進劑選自下組：鋁、鋁鹽、氧鋁復合物、或其組合。

在另一優選例中，所述細胞選自下組：原核細胞和真核細胞。

在另一優選例中，所述細胞選自下組：大腸桿菌、細菌、哺乳動物細胞(如HF9、Hela、CHO、HEK293)、植物細胞、酵母細胞、或其組合。

在另一優選例中，所述酵母細胞選自下組：釀酒酵母、畢氏酵母、克魯維酵母、或其組合；較佳地，所述的酵母細胞包括：克魯維酵母，更佳地為乳酸克魯維酵母。

在另一優選例中，所述蛋白合成體系還包括：

(b’)第二反應促進劑，所述第二反應促進劑選自下組：單糖、二糖、寡糖、可溶性淀粉、或其組合；

(c)聚乙二醇；

(d)任選的外源蔗糖；和