[發明專利]一種可視的連續空間定向進化方法

在審

• 申請號: 201711446362.3
• 申請日: 2017-12-27
• 公開（公告）號: CN109971693A
• 公開（公告）日: 2019-07-05
• 發明（設計）人: 劉陳立;賴旺生;陳茜;魏婷;孫陳健
• 申請（專利權）人: 深圳先進技術研究院
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N7/01;C12R1/92
• 代理公司: 北京超凡志成知識產權代理事務所(普通合伙) 11371
• 代理人: 張海洋

1.一種可視的連續空間定向進化方法，其特征在于，宿主在固體培養空間上進行生長與運動，所述宿主中攜帶有外來的待進化目的基因，所述宿主自身包含輔助目的基因進化的基因元件，所述目的基因與所述宿主生長運動關聯；

通過所述宿主生長運動過程中，在所述固體培養空間上形成不同的空間分布形態進行篩選得到進化產物。

2.根據權利要求1所述的一種可視的連續空間定向進化方法，其特征在于，所述目的基因位于所述宿主基因組或質粒或與所述宿主相應的寄生生物中。

3.根據權利要求1所述的一種可視的連續空間定向進化方法，其特征在于，所述寄生生物包括噬菌體、噬藻體、動植物病毒、真菌病毒、支原體、衣原體和細菌中的任一種。

4.根據權利要求1所述的一種可視的連續空間定向進化方法，其特征在于，所述寄生生物為噬菌體；

所述宿主為以下中的任一種：

所述噬菌體的非缺陷株的天然宿主菌；

所述噬菌體的非缺陷株的天然宿主菌經過遺傳改造后獲得的菌株；

經過遺傳改造后才獲得易感性的非天然宿主菌；

進一步地，所述宿主包括大腸桿菌、巴斯德菌、痢疾桿菌、假單胞菌、黃單胞菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌以及基因改造改變其易感性的改造菌株；

優選地，所述宿主為攜帶F因子的大腸桿菌。

進一步地，所述噬菌體為溫和噬菌體、烈性噬菌體或慢性感染噬菌體；

進一步地，所述噬菌體包括絲狀噬菌體、T4噬菌體、T7噬菌體、λ噬菌體、P1噬菌體、P2噬菌體、P22噬菌體、噬菌體、SP6噬菌體；

優選地，所述絲狀噬菌體包括M13絲狀噬菌體、f1絲狀噬菌體。

5.根據權利要求1所述的一種可視的連續空間定向進化方法，其特征在于，所述目的基因為一種或幾種蛋白的編碼基因和非編碼基因的組合；

進一步地，所述目的基因選自T7RNA聚合酶基因、蛋白酶基因、纖維素酶基因、熒光蛋白基因、密度感應基因中的一種或幾種。

6.根據權利要求1所述的一種可視的連續空間定向進化方法，其特征在于，所述輔助目的基因進化的基因元件為誘導突變的質粒，所述誘導突變的質粒由進化前后的目的基因分別啟動表達或誘導表達。

7.根據權利要求6所述的一種可視的連續空間定向進化方法，其特征在于，所述誘導突變的質粒包含誘變基因，所述誘變基因選自第12和14位氨基酸被突變為Ala的DNAQ基因突變體DNAQ926基因、脫氧腺苷甲基化酶dam基因、半甲基化GATC結合蛋白seqA基因、活化誘導的胞嘧啶脫氨基酶基因AID、噬菌體PBS2中的尿嘧啶DNA糖基化酶抑制基因Ugi、轉錄抑制因子emrR中的至少一種。

8.根據權利要求1所述的一種可視的連續空間定向進化方法，其特征在于，所述固體培養空間包括二維平面培養結構和三維空間培養結構；

進一步地，所述固體培養空間在垂直方向上運動進化通過定時組成澆注固體培養體系來維持連續性；

進一步地，所述定向進化為高通量進化；

進一步地，所述高通量進化選用多組固體培養空間或在固體培養空間的不同位置來實現。

9.根據權利要求4-8任一項所述的一種可視的連續空間定向進化方法，其特征在于，所述目的基因與所述宿主生長運動通過輔助質粒關聯，所述輔助質粒至少含有第一輔助質粒，所述第一輔助質粒為輔助質粒CCP1或輔助質粒CCP2，輔助質粒CCP1的核酸序列如SEQID NO：3所示，輔助質粒CCP2的核酸序列如SEQ ID NO：4所示；

進一步地，所述輔助質粒還包括第二輔助質粒，所述第二輔助質粒為輔助質粒CCP3或輔助質粒CCP4；

輔助質粒CCP3的核酸序列如SEQ ID NO：5所示。

10.根據權利要求9所述的一種可視的連續空間定向進化方法，其特征在于，所述定向進化采用不同宿主接替進行，并且后一個宿主含有的支持噬菌體增殖的基因元件包括具有支持進化后的噬菌體增殖的輔助質粒，并且抑制進化前的噬菌體增殖的輔助質粒。