[發(fā)明專利]一種液相芯片技術(shù)檢測(cè)華法林和氯吡格雷基因多態(tài)性方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201711439291.4
• 申請(qǐng)日: 2017-12-27
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN108060221A
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-05-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 付文金;許紅麗;陳梅蓮;黃志宏;鄧任堂;陳載鑫
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 東莞市厚街醫(yī)院
• 主分類號(hào): C12Q1/6883
• 分類號(hào): C12Q1/6883;C12Q1/6837
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

本發(fā)明公開(kāi)了一種液相芯片技術(shù)檢測(cè)華法林和氯吡格雷基因多態(tài)性方法，其步驟包括：a、獲取已知靶位基因標(biāo)本；b、DNA提取；c、PCR引物設(shè)計(jì)；d、利用蝦堿性磷酸酶/核酸外切酶I處理PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；e、設(shè)計(jì)高度特異性的ASPE引物；f、將ASPE產(chǎn)物與特異性熒光磁珠混合、雜交；g、在Luminex液體芯片平臺(tái)一次檢測(cè)6個(gè)變異位點(diǎn)情況；h、優(yōu)化條件確定及驗(yàn)證；i、靈敏性驗(yàn)證試驗(yàn)；j、特異性驗(yàn)證試驗(yàn)；l、靈敏度、特異性、穩(wěn)定性評(píng)估；k、以該技術(shù)檢測(cè)需要抗凝患者300例，確定本地區(qū)不同位點(diǎn)與這些基因位點(diǎn)多態(tài)性的情況。該方法能有效檢測(cè)華法林和氯吡格雷基因多態(tài)性，并能為臨床提供及時(shí)、準(zhǔn)確的用藥信息。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種液相芯片技術(shù)檢測(cè)華法林和氯吡格雷基因多態(tài)性方法。

背景技術(shù)

隨著2015年1月20日美國(guó)提出“精準(zhǔn)醫(yī)療”以來(lái),各研究領(lǐng)域已經(jīng)廣泛開(kāi)展相關(guān)研究工作，精準(zhǔn)醫(yī)療對(duì)藥物使用具有十分重要的臨床意義。在我國(guó)由于不同個(gè)體藥物代謝不同造成代謝產(chǎn)物堆積和有效濃度不足等不良反，所以依據(jù)每個(gè)個(gè)體的基因、健康差異來(lái)制定個(gè)性化治療和預(yù)防方案的新型治療方法，實(shí)現(xiàn)最安全、最經(jīng)濟(jì)、最有效的臨床應(yīng)用醫(yī)學(xué)范疇勢(shì)在必得。隨著中國(guó)老齡化增高，心血管疾病率逐年升高，使用抗血栓類藥物疾病患者人數(shù)越來(lái)越龐大，目前臨床上研究和使用治療血栓疾病的藥物主要包括抗血小板聚集的藥物、抗凝血藥物和溶血栓藥物。

華法林是目前廣泛應(yīng)用的口服抗凝藥，是治療血液栓塞性疾病的一線藥物，華法林代謝、轉(zhuǎn)運(yùn)、維生素K作用靶點(diǎn)與循壞再利用通路等相關(guān)基因多態(tài)性與個(gè)體差異具有重要關(guān)系。體內(nèi)未活化的凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ和蛋白C、S、Z必須經(jīng)ｒ-谷氨酸羧化酶（GGCX）進(jìn)行ｒ-羧化后才具有活性，進(jìn)而發(fā)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)引起血液凝固，還原型維生素K是GGCX必須的輔助因子，維生素K環(huán)氧化物環(huán)氧酶復(fù)合物1（VKORC1）將氧化型維生素K還原成還原型維生素K，華法林通過(guò)抑制VKORC1，抑制還原型維生素K生成，從而發(fā)揮抗凝作用，在肝臟細(xì)胞色素P4502C9(CYP2C9)是華法林體內(nèi)代謝的關(guān)鍵酶，華法林由S-和R-兩種消旋體構(gòu)成，其中S-華法林的抗凝活性約為R-華法林的5倍，85％以上的S-華法林在體內(nèi)經(jīng) CYP2C9代謝為無(wú)活性的代謝產(chǎn)物。造成這種藥物遺傳代謝差異的重要原因是單核苷酸多態(tài)性（ SNP ），即單個(gè)核苷酸的變異所引起的一種DNA序列多態(tài)性。CYP2C9*2（rs1799853，C430T，Arg144Cys）、CYP2C9*3（rs1057910，A1075C，Ile359Leu），這兩基因突變均導(dǎo)致CYP2C9酶活性降低，S-華法林的口服清除率分別下降90％和66％；VKORC1作為華法林的作用靶點(diǎn)，VKORC1（rs9923231，G-1639 A）影響VKORC1的表達(dá)，VKORC1多態(tài)性對(duì)華法林劑量影響的比重因種族而異，-1639GA和GG基因型對(duì)白種人華法林劑量的影響比對(duì)亞洲人的影響分別高10％和50％，但VKORC1 -1639A等位基因在亞洲人、白種人和黑種人群中的等位基因頻率分別為91.17％、38.79％和10.81％。在臨床上華法林有效用藥范圍窄，用量過(guò)高會(huì)導(dǎo)致出血，用量過(guò)低時(shí)達(dá)不到抗凝效果，因此使用過(guò)程中需頻繁檢測(cè)INR以調(diào)整劑量，給患者帶來(lái)極大的不便,所以臨床結(jié)合CYP2C9和VKORC1基因型考慮華法林初始用藥劑量及維持劑量可以大幅度減少出血等不良反應(yīng)。

氯吡格雷是目前全世界范圍內(nèi)使用最廣的噻吩吡啶類抗血小板受體P2Y12抑制劑，需要經(jīng)腸道P-糖蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)體轉(zhuǎn)運(yùn)后吸收入血，在肝臟經(jīng)細(xì)胞色素酶P450系統(tǒng)代謝后轉(zhuǎn)化為活性產(chǎn)物，其活性產(chǎn)物選擇性地、且不可逆地與血小板受體P2Y12結(jié)合，從而抑制血小板聚集，因?yàn)樗幬锎x酶的基因多態(tài)性是影響氯吡格雷的主要因素，氯吡格雷主要經(jīng)CYP2C19代謝活化后發(fā)揮抗血小板效應(yīng)，CYP2C19*2（rs4244285,G681A）、CYP2C19*3(rs4986893,G636A)這兩主要基因型突變降低酶活性，導(dǎo)致氯吡格雷療效降低。ABCB1（又稱多耐藥基因1）可以編碼小腸上皮轉(zhuǎn)運(yùn)體P-蛋白，從而影響氯吡格雷的吸收，ABCB1 C3435T(rs1045642)基因突變降低氯吡格雷的吸收。所以說(shuō)CYP2C19、ABCB1上述基因突變導(dǎo)致氯吡格雷抵抗，臨床用藥需更改其它藥物，如替格瑞洛、塞氯匹定等。