[發(fā)明專利]一種具有蛋白酶活性的多肽及其應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201711421413.7
• 申請日: 2017-12-25
• 公開（公告）號: CN109957560B
• 公開（公告）日: 2021-06-29
• 發(fā)明（設計）人: 不公告發(fā)明人
• 申請（專利權(quán)）人: 清華大學
• 主分類號: C12N9/64
• 分類號: C12N9/64;C12N15/57;C12P21/06
• 代理公司: 北京辰權(quán)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11619
• 代理人: 郝雅娟

本發(fā)明提供了一種具有蛋白酶活性的多肽以及含有該多肽的編碼核苷酸序列的構(gòu)建體、載體、宿主細胞；更重要的是，本發(fā)明公開了一種含有多肽的試劑盒以及該具有蛋白酶活性的多肽在切割融合蛋白標簽中的應用。該多肽具有高度的酶切序列專一性，可以作為一種專門用于特異性切除重組表達蛋白的標簽的工具酶。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種具有蛋白酶活性的多肽及其在蛋白切割，尤其是融合蛋白標簽切除中的用途。

背景技術(shù)

蛋白標簽(Proteintag)是指利用DNA體外重組技術(shù)，與目的蛋白一起融合表達的一種多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表達、檢測、示蹤和純化等。同時將目的蛋白和融合標簽進行融合表達是提高蛋白可溶性、增加蛋白表達量，并且有利于分離純化的有效方法之一。融合蛋白在純化后，通過蛋白酶的酶切而使目的蛋白和融合標簽相分離而釋放目的蛋白，因此隨著蛋白標簽的不斷發(fā)展，切除蛋白標簽的酶供不應求。

煙草蝕紋病毒蛋白酶(Tobacco etch virus protease，TEV蛋白酶)，酶切位點Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln/Gly(Invitrogen–LifeTechnologies)，是來源于煙草蝕紋病毒(Tobacco etch virus，TEV)的Nla蛋白酶經(jīng)改進后的50kDa的蛋白酶，經(jīng)過設計后與天然TEV蛋白酶相比其穩(wěn)定性更好。此蛋白酶常被用來切除純化后融合蛋白的親和標簽。TEV蛋白酶具有很強的位點特異性，能夠識別EXXYXQ(G/S)的七氨基酸序列(其中X是任意氨基酸)，最普通的是ENLYFQG(Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly)，其切割位點在谷氨酰胺和甘氨酸或絲氨酸之間。蛋白酶在G/S(或P1)位點切割多種氨基酸序列，為切割后C端融合部分提供一個想要的N端氨基酸。在pH 7.0，30℃時可達到最佳活性，但在pH 5.5-8.5和4-30℃的廣泛范圍內(nèi)TEV蛋白酶皆有活性，使得反應條件的選擇可根據(jù)目的蛋白的情況而修改。切割后也很容易利用其N端的HQ標簽進行TEV蛋白酶清除。也可以從固定在樹脂上的融合蛋白切除掉目的蛋白。

PreScission(Amersham-Biosciences)是一種由人鼻病毒14型的3C蛋白酶和GST組成的融合蛋白。這種蛋白酶特異識別短肽Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln/Gly-Pro中的Gln和Gly殘基而進行切割，底物的識別和切割不僅依賴于融合蛋白的一級結(jié)構(gòu)還依賴于融合蛋白的二級和三級結(jié)構(gòu)。它可以特異性的將pGEX-6P系列等載體表達出的帶有酶底物識別多肽序列融合蛋白的GST標簽進行分離。

TAGZyme：His-tag removal by Exoproteolytic Digestion系統(tǒng)的主要組成部分，是一種外切蛋白酶——二肽氨基肽酶Ⅰ(dipeptidyl aminopeptidase I，DAPase)，如果表達的外源蛋白不含有外切酶識別的停頓位點，那么還需要聯(lián)合使用谷氨酸循環(huán)轉(zhuǎn)移酶(glutamine cyclotransferase Qcyclase)和焦谷氨酸氨基肽酶(pyroglutamyl aminopeptidasep GAPase)(Intein Site dithiothreitol cleavage)。這些酶都經(jīng)過重組可以通過Ni-NTA填料除去。應用TAGZyme系統(tǒng)的反應是十分靈敏的，不會存在有內(nèi)切的現(xiàn)象，并且切割效率高，一些靈敏的蛋白可以在4℃進行反應，最大程度地防止了蛋白的降解。這個系列有兩個載體，當外源蛋白不含有DAPase停頓位點時，可以使用TAGZyme pQE-1，它可以在外源蛋白前面人工加入停頓位點谷氨酸殘基，之后利用Qcyclase將它轉(zhuǎn)成焦谷氨酸成為一個外切酶的停頓位點。對于那些外源蛋白中已經(jīng)含有外切酶停頓位點的可以選用TAGZyme pQE-2。