[發明專利]一種無創產前親權鑒定方法及其試劑盒

在審

• 申請號: 201711408954.6
• 申請日: 2017-12-22
• 公開（公告）號: CN108220453A
• 公開（公告）日: 2018-06-29
• 發明（設計）人: 李明明;張培培;李靜;陳昌岳;周孟麗;胡秋萍;張祥林
• 申請（專利權）人: 上海美吉生物醫藥科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/6883;C12N5/073;C12N15/10
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本發明提供一種優化的無創產前親權鑒定方法及試劑盒，所述方法包括如下步驟：(1)獲取孕婦外周血樣本；(2)密度梯度離心；(3)白細胞去除；(4)免疫熒光染色、固定封片、有核紅細胞鑒定及捕獲，獲得單個有核紅細胞；(5)進行偏向性單細胞擴增；(6)STR分型檢測及親權鑒定。本發明創造性地將密度梯度離心、免疫磁珠負選、免疫熒光、激光顯微切割、單細胞擴增等優化的技術結合在一起形成系統鑒定方法，成功分離孕婦外周血中胎兒有核紅細胞，并將其成功應用于親權鑒定中。相對于現有技術，該方法更高效、更純凈、無創傷、簡單、實用、精準、損失少、成本低、方法重復性好，拓展了親權鑒定范圍，同時提高了檢測的精密度。

技術領域

本發明涉及親權鑒定領域，尤其涉及一種無創產前親權鑒定方法及其試劑盒。

背景技術

親權鑒定是指通過醫學和遺傳學等手段判別父母與子女的親權關系，目前常用的是應用STR進行鑒定。時代在進步，需求在多樣化，針對胎兒進行產前親權鑒定的需求日益增多。自從PCR技術應用到生物檢測領域，尤其是應用到STR基因座進行分析后，DNA提取便成為親權鑒定中DNA多態性分析的關鍵環節，而DNA樣品質量的好壞將直接關系到后續實驗的成敗。

伴隨高通量測序技術的快速發展，單核苷酸多態性(SNP)作為第三代遺傳標記，越來越多地成為無創傷性產前親權鑒定最新的檢測手段。相對于STR，SNP在染色體中的分布更為廣泛，數量更多，檢測方法也更方便可靠。但這并不意味著二代測序技術能夠即刻大范圍應用于親權鑒定：第一，目前二代測序的成本較高，不能被親權鑒定應用廣泛接受；第二，二代測序平臺都不可避免地存在一定比例的錯誤率，技術解決方案還未完全成熟完整，達不到DNA數據庫引入要求；最后，二代測序解讀規則尚未制定，不能應用于全國實驗室數據共享范圍。因此，對已有STR數據庫的充分應用成為目前無創傷性的產前親權鑒定最經濟實惠的檢測方案。

傳統有創傷性的產前診斷技術如羊水穿刺、絨毛穿刺等由于需要從胎兒組織取樣從而具有較高的流產風險，對母體和胎兒造成危害，尤其是對于高齡產婦而言更加嚴重。所以無創傷性產前診斷技術成為當今研究熱點。胎兒有核紅細胞(Fetal Nucleated RedBlood Cells，FNRBC)是一種單核細胞，于孕6周至分娩后幾個月內持續存在于母體外周血中，細胞生命周期短、含有胎兒基因的全部遺傳信息、便于遺傳學和分子生物學分析。因此被認為是最好的產前診斷材料，從孕婦外周血中分離胎兒有核紅細胞為無創傷性產前親權鑒定開辟了新途徑。

近年來，許多研究都致力于胎兒有核紅細胞的富集。但是由于胎兒有核紅細胞在孕婦外周血中的數量極少，通常孕婦外周血中胎兒有核細胞與孕婦有核細胞的比例約為1：10⁶，高效率和高純度的分選一直是一個難題，從而導致DNA抽提困難，達不到檢測輸入量而影響STR擴增鑒定。

為了解決這一問題，本發明涉及一種更佳的改進的無創產前親權鑒定方法及其試劑盒，可以高效率和高純度地成功分離胎兒有核細胞，同時創造性地將單細胞(pg，皮克)級的樣本總量擴增至常規STR鑒定需要的納克級(約150-150000個細胞DNA量)，整個流程無需純化及轉管即可進行STR鑒定，同時可以防止純化及轉管帶來的樣本損失或污染，從而使得樣本損失更小，污染更少。

同時為了解決單細胞擴增偏向性的問題，本發明同時提供了一種改進優化的單細胞擴增方法，通過調節引物設計及配比，對定向區域片段進行相對富集，降低擴增偏向性，保證STR檢測的成功率及準確度。

本專利創造性地將密度梯度離心、免疫磁珠負選、免疫熒光、激光顯微切割、單細胞擴增等改進優化的技術有機結合在一起形成系統鑒定方法，成功分離孕婦外周血中的胎兒有核紅細胞，并將其成功應用于親權鑒定中。相對于現有技術，該方法更高效、更純凈、無創傷、簡單、實用、精準、損失少、成本低、方法重復性好，拓展了親權鑒定的范圍，同時提高了檢測的精密度。

發明內容