[發(fā)明專利]一種人多能干細(xì)胞分化為視網(wǎng)膜組織的簡易高效可機(jī)械化的誘導(dǎo)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201711395957.0
• 申請(qǐng)日: 2017-12-21
• 公開（公告）號(hào): CN109423480B
• 公開（公告）日: 2022-04-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 葛堅(jiān);羅子明;鐘秀風(fēng);李凱婧
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中山大學(xué)中山眼科中心
• 主分類號(hào): C12N5/079
• 分類號(hào): C12N5/079
• 代理公司: 廣州科粵專利商標(biāo)代理有限公司 44001
• 代理人: 劉明星

本發(fā)明公開了一種人多能干細(xì)胞分化為視網(wǎng)膜組織的簡易高效可機(jī)械化的誘導(dǎo)方法。包括將hPSCs消化得到細(xì)胞沉淀，再將細(xì)胞沉淀培養(yǎng)得到擬胚體，擬胚體經(jīng)誘導(dǎo)分化得到3D視網(wǎng)膜組織，其特征在于，所述的將hPSCs消化得到細(xì)胞沉淀，再將細(xì)胞沉淀培養(yǎng)得到擬胚體是將hPSCs消化成單細(xì)胞，然后收集細(xì)胞加入到培養(yǎng)容器中，細(xì)胞重聚形成擬胚體。本發(fā)明能使視網(wǎng)膜組織的誘導(dǎo)分化以及獲取成為流水線操作，可實(shí)現(xiàn)工廠化生產(chǎn)，以供大規(guī)模臨床應(yīng)用或藥物篩選使用。

技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明屬于干細(xì)胞誘導(dǎo)分化技術(shù)領(lǐng)域，具體技術(shù)涉及一種人多能干細(xì)胞向三維視網(wǎng)膜組織分化的程控化的誘導(dǎo)方法。

背景技術(shù)：

人多能干細(xì)胞(Human pluripotent stem cell,hPSC)，包括胚胎干細(xì)胞(Embryonic stem cell,ESC)和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(Induced pluripotent stem cell,iPSC)具有多向分化的潛能，即在特定條件下可以定向分化為幾乎機(jī)體所有的細(xì)胞。干細(xì)胞再生技術(shù)的突破為難治性疾病的發(fā)病機(jī)制、新藥開發(fā)和細(xì)胞治療等研究帶來了前所未有的機(jī)遇。其中，體外誘導(dǎo)hPSC向視網(wǎng)膜細(xì)胞甚至組織分化的關(guān)鍵技術(shù)先后取得突破，成為干細(xì)胞體外再生器官的領(lǐng)跑者，相關(guān)的臨床實(shí)驗(yàn)也正在緊鑼密鼓的進(jìn)行.。尤其是從2006年，SasaiY團(tuán)隊(duì)(Sasai Y,Cell stem cell,2012)率先報(bào)道了ESC自組裝為視泡結(jié)構(gòu)的研究后，hPSC向視網(wǎng)膜組織分化的研究進(jìn)入了新的發(fā)展階段。進(jìn)一步，Zhong XF等研究人員(NatureCommu.2014)采用特定的視網(wǎng)膜誘導(dǎo)分化液，以小片狀的hiPSC為起始分化細(xì)胞，首先懸浮培養(yǎng)獲得細(xì)胞凝聚體，第7天再貼壁培養(yǎng)以獲得片狀或環(huán)狀分布的NR/RPE，后者機(jī)械分離后再懸浮培養(yǎng)，也獲得了三維立體的視網(wǎng)膜組織。3D誘導(dǎo)技術(shù)獲得的視網(wǎng)膜組織具有早期人胚胎視網(wǎng)膜的形態(tài)特征和層次結(jié)構(gòu)，包含有主要視網(wǎng)膜細(xì)胞類型，在藥物篩選以及臨床移植供體方面具有廣闊的應(yīng)用前景和市場(chǎng)開發(fā)潛力。

但是，由于hPSC(包括ESC和hiPSC等)本身具有的異質(zhì)性特征，誘導(dǎo)分化過程中的不同步和飄忽不定的成功率也極大地制約了這項(xiàng)技術(shù)在臨床上的應(yīng)用。目前制約視網(wǎng)膜組織大規(guī)模誘導(dǎo)分化及臨床應(yīng)用的關(guān)鍵點(diǎn)主要包括以下幾個(gè)：1)目前常用的誘導(dǎo)分化方案都不是普遍適用于所有的干細(xì)胞系，個(gè)別細(xì)胞系無法成功分化，這嚴(yán)重制約了今后實(shí)現(xiàn)同種同體移植的應(yīng)用；2)多數(shù)方案以小片狀的(大小及數(shù)量難以控制)，而非單個(gè)的hPSC為起始分化細(xì)胞,導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)重復(fù)性差，難以實(shí)現(xiàn)規(guī)模化同質(zhì)化生產(chǎn)；3)所有方案在起始分化階段都使用了大量的干細(xì)胞，培養(yǎng)液、誘導(dǎo)因子、培養(yǎng)板等消耗量大，導(dǎo)致成本高，效率低，無法滿足今后供藥物篩選應(yīng)用的數(shù)量要求；4)研究人員需要較長的培訓(xùn)時(shí)間來掌握此分化技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容：

本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有誘導(dǎo)分化方案的局限性，如不能普遍適用，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性差，分化同質(zhì)性差，學(xué)習(xí)時(shí)間長等缺點(diǎn)，而提供了一種能使視網(wǎng)膜組織的誘導(dǎo)分化以及獲取成為流水線操作，可實(shí)現(xiàn)工廠化生產(chǎn)，以供大規(guī)模臨床應(yīng)用或藥物篩選的人多能干細(xì)胞分化為視網(wǎng)膜組織的簡易高效可機(jī)械化的誘導(dǎo)方法。

本發(fā)明的人多能干細(xì)胞分化為視網(wǎng)膜組織的簡易高效可機(jī)械化的誘導(dǎo)方法，包括將hPSCs消化得到細(xì)胞沉淀，再將細(xì)胞沉淀培養(yǎng)得到擬胚體，擬胚體經(jīng)誘導(dǎo)分化得到3D視網(wǎng)膜組織，其特征在于，

所述的將hPSCs消化得到細(xì)胞沉淀，再將細(xì)胞沉淀培養(yǎng)得到擬胚體是將hPSCs消化成單細(xì)胞，然后收集細(xì)胞加入到培養(yǎng)容器中，細(xì)胞重聚形成擬胚體。

所述收集細(xì)胞加入到培養(yǎng)容器中優(yōu)選是收集細(xì)胞按150～300個(gè)細(xì)胞構(gòu)成1個(gè)擬胚體的比例將細(xì)胞加入到培養(yǎng)容器中。

所述的擬胚體經(jīng)誘導(dǎo)分化得到3D視網(wǎng)膜組織優(yōu)選在誘導(dǎo)分化過程中監(jiān)測(cè)細(xì)胞的DKK-1表達(dá)情況，以將細(xì)胞加入到培養(yǎng)容器中構(gòu)建擬胚體當(dāng)天記為第0天，次日記為第1天，以此類推，如果DKK-1表達(dá)量在第3天-第28天基本滿足對(duì)數(shù)增長，則無需額外添加DKK-1，如果DKK-1表達(dá)量在第22天前開始出現(xiàn)下降，則從第7天開始補(bǔ)充DKK-1蛋白直至第22天。