[發明專利]一種人多能干細胞分化為視網膜組織的簡易高效可機械化的誘導方法

有效

• 申請號: 201711395957.0
• 申請日: 2017-12-21
• 公開（公告）號: CN109423480B
• 公開（公告）日: 2022-04-12
• 發明（設計）人: 葛堅;羅子明;鐘秀風;李凱婧
• 申請（專利權）人: 中山大學中山眼科中心
• 主分類號: C12N5/079
• 分類號: C12N5/079
• 代理公司: 廣州科粵專利商標代理有限公司 44001
• 代理人: 劉明星

1.一種人多能干細胞分化為視網膜組織的簡易高效可機械化的誘導方法，包括將hPSCs消化得到細胞沉淀，再將細胞沉淀培養得到擬胚體，擬胚體經誘導分化得到3D視網膜組織，其特征在于，

所述的將hPSCs消化得到細胞沉淀，再將細胞沉淀培養得到擬胚體是將hPSCs消化成單細胞，然后收集細胞加入到培養容器中，細胞重聚形成擬胚體；

所述的擬胚體經誘導分化得到3D視網膜組織，其在誘導分化過程中監測細胞的DKK-1表達情況，以將細胞加入到培養容器中構建擬胚體當天記為第0天，次日記為第1天，以此類推，如果DKK-1表達量在第22天前開始出現下降，則從第7天開始補充DKK-1蛋白直至第22天；

所述收集細胞加入到培養容器中是收集細胞按150~300個細胞構成1個擬胚體的比例將細胞加入到培養容器中；

所述的從第7天開始補充DKK-1蛋白直至第22天，其DKK-1蛋白的補充量是每天一次，按每ml培養液補充100ng DKK-1蛋白的量補充。

2.根據權利要求1所述的誘導方法，其特征在于，所述的將hPSCs消化成單細胞是取生長80% 融合度的 hPSCs，刮除分化細胞，吸去培養液，PBS潤洗后用0.5mM EDTA 37℃消化6min，再吸除EDTA，用mTeSR1吹落細胞，并吹打分散為單個細胞，離心收集細胞，用mTeSR1培養液重懸細胞，得到細胞懸液，按150~300個細胞構成1個擬胚體的比例，以瓊脂微孔板作為培養容器，將瓊脂微孔板置于24 孔板中，每孔一個瓊脂微孔板，按每個瓊脂微孔板上的微孔制備1個擬胚體，每個微孔中加入含150~300個細胞的細胞懸液，37 ℃ CO₂培養箱中培養，待細胞均勻沉入微孔底后，沿著24孔板的孔壁與微孔板之間緩慢添加1.5 ml含有10μMBlebbistatin的mTeSR I培養液于每一孔繼續培養。

3.根據權利要求1所述的誘導方法，其特征在于，所述的擬胚體經誘導分化得到3D視網膜組織具體為：以將細胞加入到培養容器中構建擬胚體當天記為第0天，次日記為第1天，以此類推，第1天，24孔板孔內培養液替換為體積分數25% NIM+體積分數75% mTeSR1，共1.5ml/孔，第2天，培養液替換為體積分數50% NIM+體積分數50% mTeSR1，共1.5ml/孔，并在這一天用Matrigel包被六孔板，37℃過夜，第3天，吸取六孔板中的Matrigel，加入NIM培養液4ml/孔，用無菌鑷夾起24孔板中的1個瓊脂微孔板倒扣到六孔板的1個孔中，并用移液槍吹打瓊脂微孔板的加樣槽，將擬胚體吹落，六孔板放入37 ℃ CO₂培養箱后，十字搖勻法搖勻，開始貼壁培養，第4-8天密切觀察培養液性狀，若無培養液發黃跡象可不更換培養液，第9天，全量更換NIM培養液，以去除死細胞，第10-15天，隔天更換NIM培養液，第16天，吸凈NIM培養液，更換為RDM培養液，第17-28天，每日半量換RDM培養液，如果DKK-1表達量在第22天前開始出現下降，則從第7天開始每天補充一次DKK-1蛋白到培養液中，按每ml培養液補充100ng DKK-1蛋白的量補充，直至第22天；

所述的NIM培養液為DMEM/F12 500ml、100× N2 5ml、2mg/ml Heparin 0.5ml、100×MEM-NEAA 5ml；

所述的RDM培養液為DMEM/F12 300ml、DMEM basic 200ml、50× B27 without vitaminA 10ml、100× antibiotic and antimycotic 5ml、100× MEM-NEAA 5ml。