[發明專利]一種基因敲除選育rmnd5b基因缺失型斑馬魚的方法

在審

• 申請號: 201711384128.2
• 申請日: 2017-12-20
• 公開（公告）號: CN108018316A
• 公開（公告）日: 2018-05-11
• 發明（設計）人: 鄧云;潘琪;吳秀山;袁婺洲;歐陽詩
• 申請（專利權）人: 湖南師范大學
• 主分類號: C12N15/90
• 分類號: C12N15/90;A01K67/027
• 代理公司: 長沙楚為知識產權代理事務所(普通合伙) 43217
• 代理人: 李大為

本發明公開了一種基因敲除選育rmnd5b基因缺失型斑馬魚的方法，屬于基因敲除領域。該方法通過CRISPR/Cas9基因敲除靶位點設計，構建gRNA表達載體以及gRNA體外合成，斑馬魚胚胎進行顯微注射，檢測靶位點的有效性，注射兩個月之后，進行剪尾鑒定，對目的序列進行TA克隆，質粒進行Sanger測序獲得可遺傳的斑馬魚突變體的F1代，從F1代突變體中挑選相同突變的雌魚和雄魚，雜交獲得斑馬魚突變體的F2，從中挑選出F2代純合子，進行F3代純系遺傳得到rmnd5b基因缺失型斑馬魚品系。本發明方法脫靶率較低，且研究rmnd5b基因的缺失與其他器官的發育的相關性，具有很好的醫學研究價值。

技術領域

本發明屬于基因敲除領域，更具體地說，涉及一種基因敲除選育rmnd5b基因缺失型斑馬魚的方法。

背景技術

RMND5B(required for meiotic nuclear division 5homolog B)基因位于人類5q35.3，編碼391個氨基酸。一般認為該基因在人類早期胚胎的多個組織中有表達，在心臟、肝和腎中的表達水平較強。通過基因差異表達譜分析和基因組關聯分析等，發現RMND5B基因與心臟早期發育密切相關。

斑馬魚與人類在心臟發育過程中的基因、信號通路有高度同源性，且RMND5B基因進化上較為保守，人類RMND5B基因對應于斑馬魚rmnd5b基因，研究發現rmnd5b在斑馬魚胚胎早期表達量特別高。而且，與其他動物模型相比，斑馬魚個體小、幼魚通體透明，利于心臟發育的觀察。

基因打靶技術起源于20世紀80年代末，是一種通過對基因組進行定點修飾來研究基因功能的重要的方法手段，也可用于治療人類的各種遺傳性疾病。該技術主要是利用缺失突變、基因滅活、染色體大片段刪除以及外源基因導入等方式來改變生物的遺傳信息，并且在生殖系中穩定遺傳后表達突變性狀，從而研究生物體內特定基因在生長發育過程中的作用，所以這類技術手段已成為現代分子生物學研究熱點。傳統的基因打靶技術是建立在胚胎干細胞(ESC)和同源重組技術的基礎之上，故打靶技術效率極低。2013年初，一種全新的人工核酸內切酶clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)/CRISPR-associated(Cas)9，能更高效且更精確地在生物體基因組中沉默特定基因，且制作簡單、成本低，且可同時對靶基因上多個位點進行剪切，沉默任意數目的單個基因，但同時該技術存在一定的缺陷，其脫靶率相對較高。

發明內容

針對現有基因打靶技術中存在的脫靶率相對較高問題，本發明提供了一種基因敲除選育rmnd5b基因缺失型斑馬魚的方法，能更高效且更精確地在生物體基因組中沉默特定基因，且制作簡單、成本低，且可同時對靶基因上多個位點進行剪切，沉默任意數目的單個基因，脫靶率較低，且研究rmnd5b基因的缺失與其他器官的發育的相關性，具有很好的醫學研究價值。

解決上述技術問題的技術方案如下：

A.CRISPR/Cas9基因敲除靶位點設計

在National Center for Biotechnology Information(NCBI)上查詢斑馬魚rmnd5b基因的基因組DNA序列及其功能結構域，根據CRISPR/Cas敲除原理，在網站TheZiFiT Targeter(http://zifit.partners.org/ZiFiT_Cas9)上設計一對rmnd5b基因的靶位點。靶點的選擇必須遵循此標準：5’-GG-(N)18-NGG-3’。其中5’端的GG二核苷酸是T7啟動子的一部分，設計靶位點時可以不受此限制，但是必須保證靶位點的3’端是NGG。靶點的選擇必須確保靶點位置堿基的插入或者缺失可以影響rmnd5b基因的整個結構域，從而改變基因的表達。

兩對特異性PCR引物如下：

F1(靶位點a正向引物)：