[發(fā)明專利]一種改進(jìn)的Golgi?Cox染色制備腦組織石蠟切片的方法

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• 申請日: 2017-12-20
• 公開（公告）號: CN107941587A
• 公開（公告）日: 2018-04-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張海彬;范瑞芳;李楚華;龐啟華
• 申請（專利權(quán)）人: 華南師范大學(xué)
• 主分類號: G01N1/30
• 分類號: G01N1/30
• 代理公司: 廣州市華學(xué)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司44245
• 代理人: 郭煒綿

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于神經(jīng)組織染色、制片領(lǐng)域，具體涉及一種改進(jìn)的Golgi-Cox染色制備腦組織石蠟切片的方法，其特點(diǎn)是簡易和高效。

背景技術(shù)

高爾基染色法作為神經(jīng)組織學(xué)的一種經(jīng)典染色方法，可以清晰揭露神經(jīng)元精細(xì)的形態(tài)結(jié)構(gòu)，如胞體、軸突、樹突及樹突棘等，是定性定量分析神經(jīng)元形態(tài)的重要手段。

目前，Golgi-Cox染色法、Golgi-Kopsch法及快速高爾基染色法是三種被廣泛應(yīng)用的神經(jīng)元染色方法。其中，Golgi-Cox法由于染色結(jié)果穩(wěn)定、背景顏色干擾小等優(yōu)點(diǎn)而應(yīng)用最廣泛。

但傳統(tǒng)的Golgi-Cox法有以下缺點(diǎn)：

(1)操作流程繁瑣、耗時(shí)。整個(gè)過程包括Golgi-Cox溶液的配制(2天)、腦組織樣品浸染(14天)、腦組織脫水及切片制樣(3天)、切片晾干(1-3天)、切片顯影、脫水、透明及封片處理。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程耗時(shí)長達(dá)約一個(gè)月，大大影響了實(shí)驗(yàn)進(jìn)度，限制了Golgi-Cox法的應(yīng)用；

(2)腦組織樣品在Golgi-Cox溶液中浸染14天后變得很脆弱，無論是使用振動切片還是冰凍切片技術(shù)，均產(chǎn)生嚴(yán)重的碎片、裂片問題，導(dǎo)致腦片不完整，從而影響后續(xù)神經(jīng)元的形態(tài)分析；

(3)Golgi-Cox溶液含有大量重金屬成分，腦組織樣品在Golgi-Cox溶液浸染期間，隔6小時(shí)或者一到兩天后需要更換新鮮Golgi-Cox溶液，不僅耗量大、操作繁瑣，而且廢液處理過程中容易造成二次環(huán)境污染問題；

(4)由于傳統(tǒng)制作方法中腦片的厚度較大，在顯影過程中，掉片問題嚴(yán)重。這也是讓實(shí)驗(yàn)者頭疼的一個(gè)問題。

詳細(xì)的Golgi-Cox染色操作流程于1981年公開發(fā)表，隨后在1986年科學(xué)家開始應(yīng)用冷凍切片制樣法獲得腦組織切片，1998年發(fā)展成振動切片制樣法。目前，冰凍切片制樣法及振動切片制樣法是Golgi-Cox染色制得腦組織切片的兩種應(yīng)用最廣泛的手段。

當(dāng)前很多市售的高爾基染色試劑盒是基于傳統(tǒng)的Golgi-Cox染色法發(fā)展而來的，比如國外生產(chǎn)的“HITO GOLGI-COX OPTIMSTAIN^TM PREKIT”和“FD快速高爾基染色試劑盒”，除了價(jià)格高、染色時(shí)間較長(2周)外，后期還局限于冰凍切片機(jī)及振動切片機(jī)制樣。因此這兩種制樣法均有很大的局限性：冰凍切片機(jī)制作高爾基染色的腦組織切片時(shí)特別容易產(chǎn)生碎片、裂片問題，即使是熟手操作也難以避免；振動切片機(jī)則價(jià)格高昂，一般實(shí)驗(yàn)室難以負(fù)擔(dān)。并且由于振動切片機(jī)一般更多用于制作活性切片，因此如將振動切片機(jī)同時(shí)應(yīng)用于高爾基染色切片制樣，過程中產(chǎn)生的交叉污染問題會影響對腦片活性要求較高的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，因此限制了高爾基染色實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行和普及。

而常規(guī)的石蠟切片技術(shù)因其繁瑣的前處理步驟及后期難控的切片透明操作，使得切片的完整性難以保證，神經(jīng)元損傷嚴(yán)重，從而影響其形態(tài)學(xué)分析，因此，高爾基染色的常規(guī)石蠟切片制樣法沒有得到廣大科研人員的廣泛采用。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有Golgi-Cox染色法存在的缺點(diǎn)與不足，提供一種改進(jìn)的Golgi-Cox染色制備腦組織石蠟切片的方法，其中的染色方法可以清晰顯示神經(jīng)元的形態(tài)特征，具有快速、經(jīng)濟(jì)、高質(zhì)量的特點(diǎn)。

本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種制備腦組織石蠟切片的方法，包括以下步驟：

(1)配制Golgi-Cox快速染色工作液并進(jìn)行腦組織快速染色

等體積混合A液、B液和C液，避光靜置1-2天，分層后取上清作為工作液；將腦組織浸泡在工作液中，37℃恒溫避光浸染2天；

所述的A液是5％(W/V)重鉻酸鉀水溶液，B液是5％(W/V)氯化汞水溶液，C液是5％(W/V)鉻酸鉀水溶液；

Golgi-Cox的染色機(jī)理至今還不是很確切，當(dāng)前大家公認(rèn)的可能機(jī)理是：汞在鉻酸鹽的幫助下與蛋白質(zhì)結(jié)合，白色的汞和硫代硫酸鈉發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生黑色的硫化汞從而可視。