[發(fā)明專利]一種檢測山茶屬植物細胞核DNA含量的方法在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 201711375776.1 | 申請日： | 2017-12-19 |
| 公開（公告）號： | CN108165645A | 公開（公告）日： | 2018-06-15 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 殷恒福;楊穩(wěn);呂燾;李紀元;李辛雷;范正琪 | 申請（專利權(quán)）人： | 中國林業(yè)科學研究院亞熱帶林業(yè)研究所 |
| 主分類號： | C12Q1/6895 | 分類號： | C12Q1/6895;C12Q1/6806;C12Q1/6851;A01H4/00 |
| 代理公司： | 北京華夏正合知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11017 | 代理人： | 韓登營;陳辰 |
| 地址： | 311400 浙*** | 國省代碼： | 浙江;33 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 山茶屬植物 細胞核 細胞核DNA 裂解溶液 外植體 種檢測 誘導愈傷組織 多倍體育種 流式細胞儀 消毒預處理 應(yīng)用意義 愈傷組織 基因組 染色 莖段 切取 葉片 制備 過濾 誘導 檢測 分析 檢查 | ||
本發(fā)明提供了一種檢測山茶屬植物細胞核DNA含量的方法，包括如下步驟：切取山茶屬植物葉片或莖段，獲取外植體；對所述外植體進行消毒預處理；誘導愈傷組織；處理經(jīng)誘導的愈傷組織，使其發(fā)生細胞核分離,過濾；對步驟(4)得到的濾液進行染色以制備待測細胞核裂解溶液；以及通過流式細胞儀檢測所述待測細胞核裂解溶液的細胞核DNA含量。本發(fā)明的方法在山茶屬植物的倍型檢查、基因組大小測定等方面具有應(yīng)用意義，為山茶屬植物的多倍體育種提供了新的分析技術(shù)。
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及一種利用山茶屬植物愈傷組織分析細胞核DNA含量的方法。
背景技術(shù)
山茶屬物種資源豐富，包含許多具有重要經(jīng)濟價值的木本植物。研究表明植物細胞核的DNA含量(倍性)與形態(tài)、抗性等性狀具有相關(guān)性，使得倍性育種成為獲得新品種、新種質(zhì)的重要途徑。
流式細胞技術(shù)(Flow Cytometry)是二十世紀末興起的分析技術(shù)，也是分析植物細胞核DNA含量的最重要的手段之一。利用流式細胞手段，精確且高效地檢測山茶屬植物細胞核DNA的含量，是山茶屬植物倍性育種的關(guān)鍵技術(shù)。但是，山茶屬植物的組織中含有復雜的次生代謝物質(zhì)，使得常規(guī)的細胞核裂解液體系(如Galbraith緩沖液、LB01溶液、Otto’s緩沖液等)極易氧化造成渾濁和粘稠，不能用于流式細胞分析。
在山茶屬植物的研究中，Huang等(PLoS ONE 8(5):e64981DOI:10.1371/journal.pone.0064981)于2013年報道了一種通過利用完整植物組織分解細胞核，并檢測基因組DNA含量的方法。該報道中，研究者配制了一種細胞核裂解液，WPB溶液(Tris 0.2M,MgCl2 4mM,EDTA-Na2 2mM,NaCl 86mM,二硫蘇糖醇DTT 20mM,聚乙烯吡咯烷酮PVP-10 1％(質(zhì)量體積比),Triton X-100 1％(體積比),PH＝7.5)，直接利用嫩葉、芽組織進行處理，進而開展流式細胞分析測定細胞核的DNA含量。通過添加大量抗氧化劑(DTT)和單寧結(jié)合物質(zhì)(PVP-10)，所述WPB緩沖液在一定程度上解決了組織裂解液的沉淀和背景熒光的問題，但是采用該技術(shù)的成功率不高，且測定的結(jié)果誤差較大，具體缺陷如下：(1)該方法對植物材料要求較高，必須使用十分幼嫩的組織進行實驗；(2)有些山茶屬材料(如油茶、茶梅等)，即使是嫩葉或嫩芽中，也含有大量的次數(shù)代謝物質(zhì)，特別是單寧類物質(zhì)能與所用的DNA染料結(jié)合，造成測量結(jié)果的誤差變異增大；(3)細胞核裂解液中包含了高濃度的PVP-10(1％，質(zhì)量體積比)和DTT(20mM)，造成裂解液粘稠，易堵塞流式細胞儀的管路系統(tǒng)。
因此,目前對于如何通過流式細胞儀準確測定山茶屬植物的細胞核DNA含量仍然是一個亟需解決的技術(shù)難題。
發(fā)明內(nèi)容
為了解決目前利用新鮮組織檢測山茶屬植物細胞核DNA中的技術(shù)缺陷，本發(fā)明的目的在于提供一種通過誘導愈傷組織開展流式細胞分析的技術(shù)體系。
本發(fā)明提供了一種檢測山茶屬植物細胞核DNA含量的方法，包括如下步驟：
(1)切取山茶屬植物葉片或莖段，獲取外植體；
(2)對所述外植體進行消毒預處理；
(3)誘導愈傷組織；
(4)處理經(jīng)誘導的愈傷組織，使其發(fā)生細胞核分離,過濾；
(5)對步驟(4)得到的濾液進行染色以制備待測細胞核裂解溶液；以及(6)通過流式細胞儀檢測所述待測細胞核裂解溶液的細胞核DNA含量。
本發(fā)明還提供了上述方法在山茶屬植物的倍型檢查、基因組大小測定以及多倍體育種方面的應(yīng)用
基于此，本發(fā)明的突出優(yōu)點在于：
與現(xiàn)有的技術(shù)相比，
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