[發(fā)明專利]一種脲基甲酸水解酶及其制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201711374808.6
• 申請日: 2017-12-19
• 公開（公告）號: CN107988193B
• 公開（公告）日: 2021-05-28
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 宮春杰;薛棟升;陶冶;胡征;楊波
• 申請（專利權(quán)）人: 湖北工業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N9/80
• 分類號: C12N9/80;C12N15/55;C12N15/70;C12N15/11;C07K16/40;C07K16/06
• 代理公司: 武漢開元知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 42104
• 代理人: 王和平

本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及一種脲基甲酸水解酶及其制備方法。包括以下步驟：1)利用PCR技術(shù)擴增得到脲基甲酸水解酶的克隆，2)構(gòu)建脲基甲酸水解酶的表達載體；3)將表達載體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)菌體中得到重組菌體，進一步誘導(dǎo)表達、和純化蛋白得到脲基甲酸水解酶。該方法簡單，易操作，且發(fā)現(xiàn)了新的基因序列的脲基甲酸水解酶，該酶在低溫條件下依然具備較強的酶學(xué)活性。另外，本發(fā)明還提供該脲基甲酸水解酶的多克隆抗體以及其檢測方法，對低溫菌Cryobacterium屬菌種的鑒定提供新的依據(jù)，對于脲基甲酸水解酶的研究提供了新的研究方向。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，主要涉及一種脲基甲酸水解酶及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

脲基甲酸水解酶，英文名：Allophanate hydrolase。脲基甲酸水解酶在三嗪類除草劑的降解過程中起重要作用，它催化降解脲基甲酸，生成氨氣和二氧化碳。對于如阿拉特津除草劑等含有三嗪的污染物具有降解作用，在環(huán)境保護領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

利用脲基甲酸水解酶降解除草劑污染物的中間體脲基甲酸具有極大的應(yīng)用前景，在低溫條件條件下，以脲基甲酸為底物降解生成氨氣，凈化環(huán)境具有較好的效果。

目前生產(chǎn)得到的脲基甲酸水解酶對低溫的耐受能力差，在低溫下幾乎不能發(fā)揮活性，在工業(yè)生產(chǎn)上，對溫度的要求較高。

發(fā)明內(nèi)容

為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明的目的是提供一種低溫適應(yīng)性好的脲基甲酸水解酶，并相應(yīng)開發(fā)一種更高效、簡便的制備脲基甲酸水解酶的方法。

本發(fā)明提供一種脲基甲酸水解酶的氨基酸序列，所述脲基甲酸水解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本發(fā)明提供一種脲基甲酸水解酶基因的核苷酸序列，所述脲基甲酸水解酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

相應(yīng)地，本發(fā)明提供包含上述脲基甲酸水解酶基因的重組載體、重組菌株以及表達上述脲基甲酸水解酶的方法。本發(fā)明提供包含上述脲基甲酸水解酶基因的重組載體，優(yōu)選為pET21a；本發(fā)明提供包含上述脲基甲酸水解酶基因PCR擴增的引物序列，正向引物如SEQ ID NO.3所示，反向引物如SEQ ID NO.4；將本發(fā)明的脲基甲酸水解酶基因插入到表達載體合適的限制性酶切位點之間，使其核苷酸序列可操作的與表達調(diào)控序列相連接，作為本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案，具體的是將本發(fā)明的脲基甲酸水解酶基因插入到質(zhì)粒pET21a上的EcoRI和NdeI限制性酶切位點之間，使該核苷酸序列位于啟動子下游并受其調(diào)控，得到重組大腸桿菌BL21表達質(zhì)粒pET21a-APH；本發(fā)明還提供了一種表達上述脲基甲酸水解酶的方法，包括以下步驟：

1)將氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的脲基甲酸水解酶的編碼基因插入到質(zhì)粒pET21a上的EcoRI和NdeI限制性酶切位點之間，得到重組大腸桿菌BL21表達質(zhì)粒pET21a-APH；

2)將上述重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)，得到重組菌株Ecoli BL21-pET21a-APH；

3)將Ecoli BL21-pET21a-APH擴大培養(yǎng)，誘導(dǎo)表達脲基甲酸水解酶，收集菌體；

4)菌體破碎后，通過Ni-NTA親和層析色譜柱純化后得到純化的脲基甲酸水解酶。

相應(yīng)地，本發(fā)明提供上述脲基甲酸水解酶鼠來源的多克隆抗體的制備和檢測方法，包括以下步驟：

1)純化后的脲基甲酸水解酶注射小鼠，采集血清；

2)用步驟1)中得到的血清通過ELISA進行抗體對抗原的效價；

3)步驟2)中的測得的效價符合條件，即進行抗體純化；

4)將步驟3)中純化得到的抗體與脲基甲酸水解酶的原始菌株的破碎液進行Western Blotting檢測。