[發明專利]一種相同供體來源人間充質干細胞的多批次原代分離方法

有效

• 申請號: 201711347861.7
• 申請日: 2017-12-15
• 公開（公告）號: CN108251358B
• 公開（公告）日: 2021-10-26
• 發明（設計）人: 袁茵;魯欣;匡梅娜;黃思瑞
• 申請（專利權）人: 廣東藥科大學
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205
• 代理人: 胡輝

本發明公開了一種相同供體來源人間充質干細胞的多批次原代分離方法，屬于細胞培養領域。本發明方法是將供體組織處理后得到1?5mm³的供體組織小塊，通過胎牛血清或人AB血清浸泡處理，然后進行常規的組織塊貼壁培養。收獲間充質干細胞的同時，對供體組織塊進行轉板連續培養，并將組織塊的培養上清回收繼續孵育，實現來自同一供體的人間充質干細胞的高質量、多批次穩定分離。本發明所得細胞的形態、增殖及分化能力、免疫表型在各批次間均保持不變。與傳統的組織塊貼壁法和酶消化法相比，本發明方法避免了臨床標本資源的浪費，節省了臨床環節的人力物力，還提高了間充質干細胞的分離效率和產量。

技術領域

本發明屬于細胞培養領域，具體涉及一種相同供體來源人間充質干細胞的多批次原代分離方法。

背景技術

間充質干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)具有高度的自我更新和多向分化能力，不僅能夠分化為脂肪、骨、軟骨、肌肉等間質組織細胞，還具有低免疫原性和免疫抑制作用，是組織工程和細胞替代治療、移植免疫和自身免疫性疾病等治療的重要種子細胞。

上世紀七十年代，Friedenstein及其同事首先從骨髓中培養出了間充質干細胞。近年來，研究人員又陸續從其它組織，如脂肪、乳牙以及新生兒的臍帶、胎盤、羊膜、臍帶血中分離得到了MSCs。其中，新生兒的臍帶組織具有富含MSCs、取材方便且無倫理爭議等優點，被認為是獲取MSCs的一個理想來源。

人臍帶間充質干細胞(human umbilical cord-derived mesenchymal stemcells,hUC-MSCs)是區別于胚胎干細胞和成體干細胞的胎兒干細胞，是一種新的多能間質干細胞，其組織來源原始、生物性能穩定、增殖分化能力強、免疫原性低。hUC-MSCs主要存在于臍帶的華通氏膠(Wharton’s jelly)及臍靜脈內皮下層，可通過酶消化法和組織塊貼壁法獲得。

下面具體闡述現有技術中酶消化法和組織塊貼壁法兩種方法的具體操作步驟。

(1)酶消化法(以“單酶法”為例)

將臍帶剪成約2cm長的小段，用含1％雙抗的PBS緩沖液重復洗滌2-3次，除去臍帶血?？v向剪開臍帶，剔除三條血管。將剩余臍帶組織剪成小塊放進小燒杯中，用眼科剪成1-2mm³大小的組織小塊。將組織小塊移至內含磁力攪拌子的100ml無菌玻璃瓶中，加入終濃度為0.1％的膠原酶II，37℃水浴下持續磁力溫和攪拌消化2h。加入PBS緩沖液洗滌膠原，2000rpm離心15min，棄上清、留沉淀。再加入PBS將組織懸起，用尼龍網過濾，收集細胞濾液，1000rpm離心5min，棄上清。用DMEM/F12完全培養基重懸收集的細胞，吹打均勻、計數，接種于細胞培養瓶中，置于37℃、5％二氧化碳、飽和濕度的細胞培養箱內培養。24h后第一次換液，去除懸浮的細胞。以后每3d換一次液，當細胞達80％-90％融合后，進行常規傳代培養。

(2)組織塊貼壁法

將臍帶剪成約2cm長的小段，用含1％雙抗的PBS緩沖液重復洗滌2-3次，除去臍帶血?？v向剪開臍帶，剔除血管。將剩余臍帶組織剪成更小的組織小塊(常見1mm³)，按一定間距均勻平鋪在培養器皿中，后續操作分“翻轉干涸”法和“薄層培養”法兩種：

A.“翻轉干涸”法：將培養皿輕輕翻轉過來，置37℃二氧化碳培養箱培養4-6小時，待組織小塊微干涸，再緩緩把培養皿翻轉過來，慢慢加入少量完全培養基，保證培養液能夠沒過組織小塊，重新放回培養箱中靜置培養；

B.“薄層培養”法：將鋪有組織塊的培養皿正放，靜置30分鐘，使組織塊更好的貼壁，緩慢加入少量培養液覆蓋住組織塊表面，37℃二氧化碳培養箱靜置培養。

通過A或B步驟完成鋪塊后，第1～7天絕對靜置，之后每3天全量換液，觀察組織塊周邊貼壁細胞爬出情況，操作時輕拿輕放。