[發明專利]α-酮戊二酸依賴型酶的酶活檢測試劑盒及其應用

在審

• 申請號: 201711346017.2
• 申請日: 2017-12-15
• 公開（公告）號: CN109929908A
• 公開（公告）日: 2019-06-25
• 發明（設計）人: 張良;羅靜;張會冰;孟周文理
• 申請（專利權）人: 上海交通大學醫學院
• 主分類號: C12Q1/32
• 分類號: C12Q1/32;C12Q1/26
• 代理公司: 上海翼勝專利商標事務所(普通合伙) 31218
• 代理人: 翟羽

本發明公開α?酮戊二酸依賴型酶的酶活檢測試劑盒及其應用，所述試劑盒包括還原型輔酶Ⅱ(NADPH)或者還原型輔酶Ⅰ(NADH)中的一種，異檸檬酸脫氫酶IDH突變體蛋白和緩沖鹽，所述IDH突變體蛋白是指IDH特定氨基酸突變后所獲得的具有催化α?酮戊二酸(2?OG)新功能的IDH突變體蛋白。作為一個優選方案，所述試劑盒還包括競爭亞鐵離子的金屬離子。本發明提供了一種高效率高精確度檢測α?酮戊二酸含量的方法，可用于檢測α?酮戊二酸依賴型酶的酶催化活性，測定其酶動力學參數，及針對該類型酶展開高通量藥物篩選。該方法解決了α?酮戊二酸依賴型酶的酶活檢測操作繁瑣，準確度和可重復性差，通量低，難以進行高通量藥物篩選等諸多問題。

技術領域

本發明屬于生物技術檢測領域，更具體地講，涉及α-酮戊二酸依賴型酶的酶活檢測試劑盒及其應用。

背景技術

α-酮戊二酸是三羧酸循環中重要的代謝中間產物，是連接細胞內碳-氮代謝的關鍵節點。在該循環中，異檸檬酸脫氫酶(IDH)催化異檸檬酸生成α-酮戊二酸(2-OG)，而α-酮戊二酸又在α-酮戊二酸脫氫酶(OGDC)的催化下生成琥珀酰輔酶A參與下游代謝。除了作為參與三羧酸循環的重要代謝產物，α-酮戊二酸作為關鍵輔助因子還參與了大量重要的酶催化反應。其中，最具代表性的是亞鐵和α-酮戊二酸依賴型的雙加氧酶家族。該家族屬于非血紅素鐵蛋白，廣泛分布于生物體內，是參與包括蛋白、脂類、寡核苷酸等在內的生物大分子底物氧化反應的一類重要酶。目前，最具代表性的亞鐵和α-酮戊二酸依賴型雙加氧酶包括氧化核酸修飾底物的TET蛋白家族(DNA甲基化修飾)、AlkB蛋白家族(DNA和RNA上多種修飾)、FTO(RNA甲基化修飾)；以及氧化蛋白修飾底物的組蛋白去甲基化酶KDM家族(組蛋白甲基化修飾)、脯氨酰羥化酶PHD家族等等。這些亞鐵和α-酮戊二酸依賴型的雙加氧酶通常結合亞鐵離子和α-酮戊二酸作為輔助因子，并在其幫助下將氧氣提供的一個氧原子催化進入底物生成氧化產物，另一個氧原子則參與α-酮戊二酸脫羧反應生成琥珀酸。

由于該類酶的底物和產物多為生物大分子，且沒有顯著的熒光變化或其他可用于檢測的物質改變，難以高效的通過檢測底物的減少或產物的生成來檢測酶活性、測定酶動力學參數，也無法建立高通量藥物篩選體系來對這類酶進行高通量藥物篩選。

目前，對于亞鐵和α-酮戊二酸依賴型雙加氧酶的活性檢測，主要分為對生物大分子的催化產物的檢測以及對α-酮戊二酸的反應產物琥珀酸的檢測兩大類。對于前面一類檢測方法，主要檢測方法為同位素標記，質譜，核磁共振等。這類方法操作繁瑣，通量低，耗時長，可重復性差，對儀器的配置要求高，耗費高。對于第二類檢測方法，目前已報道的有以下兩種：

(1)方法一：通過與琥珀酰輔酶A合成酶-丙酮酸激酶-乳酸脫氫酶串聯偶聯反應，實現對α-酮戊二酸的反應產物琥珀酸的檢測，從而間接檢測雙加氧酶的酶活。

①依賴亞鐵和α-酮戊二酸的雙加氧酶反應過程中實現將α-酮戊二酸催化生成琥珀酸；

②琥珀酸進一步被琥珀酰輔酶A合成酶(SCS)催化生成琥珀酰輔酶A及副產物ADP；

③副產物ADP進一步參與丙酮酸激酶(PK)催化磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的反應，并催化生成丙酮酸、ATP和磷酸；

④反應產物丙酮酸和ATP在乳酸脫氫酶(LDH)的作用下生成乳酸，該反應中伴隨著NADH到NAD的催化。通過檢測NADH在340nm下吸收值的變化，可以實現第一步雙加氧酶活性的檢測。

但是，由于該方法共需涉及4步酶學級聯反應，反應體系中所涉及的反應底物和輔助因子較多，操作繁瑣，參數設置復雜，耗時長，可重復性差，耗費高。另外使用該方法進行高通量藥物篩選會導致大量假陽性和假陰性結果。

(2)方法二：通過與琥珀酰輔酶A合成酶串聯級聯反應，并使用孔雀綠染料檢測琥珀酰輔酶A合成酶催化琥珀酸過程中的副產物磷酸來間接檢測雙加氧酶的酶活性。