[發明專利]NUDT15基因分型用的引物、試劑盒及方法

有效

• 申請號: 201711332298.6
• 申請日: 2017-12-13
• 公開（公告）號: CN107988354B
• 公開（公告）日: 2021-05-14
• 發明（設計）人: 閆文瑞;蔡興盛;楊明;李夢真;鄧泱泱;余敬偉;楊冬成
• 申請（專利權）人: 廣州邁景基因醫學科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;C12N15/11
• 代理公司: 廣州華進聯合專利商標代理有限公司 44224
• 代理人: 林青中;萬志香

本發明公開了一種NUDT15基因分型用的引物、試劑盒和方法。該NUDT15基因分型用的引物、試劑盒及方法利用Taq熱啟動DNA聚合酶缺少3’?5’端外切酶活性的特點，當擴增引物的3’端堿基與模板堿基不互補時，會造成擴增產物的急劇減少，據此設計已知點突變的3條引物，其3’端堿基分別與突變型和野生型的模板堿基互補，從而可以將野生型和突變型基因區分開。本發明的NUDT15基因分型用的引物、試劑盒和方法檢測流程簡單、擴增效率高、特異性強，在分型檢測過程中，可配合內參模板、內參引物對和陽性對照、陰性對照等，對實時熒光PCR過程進行全程監控，避免出現假陰性和假陽性的結果，分型結果準確可靠。

技術領域

本發明涉及分子生物學檢測領域，尤其是涉及一種NUDT15基因分型用的引物、試劑盒及方法。

背景技術

咪唑硫嘌呤(Azathioprine，AZA)和6-巰基嘌呤(6-mercaptopurine，6-MP)等巰嘌呤類藥物廣泛用于治療癌癥、器官移植、自身免疫疾病或炎癥性疾病，如炎癥性腸病(IBD)。然而巰嘌呤類藥物會導致白細胞減少癥的發生，這種潛在危害在服用巰嘌呤類藥物的歐洲人IBD人群中高達5％。硫嘌呤甲基轉移酶(TMPT)突變與巰嘌呤類藥物引起的白細胞減少癥之間的關系已被證實，并且美國FDA推薦在服用巰嘌呤類藥物前進行TMPT檢測。然而，服用巰嘌呤類藥物引起白細胞減少癥的IBD人群，僅有約1/4攜帶TPMT突變，提示存在其他因素導致該癥狀的發生，因此TPMT檢測的有效性令人質疑。進一步研究表明，歐洲人群的TPMT突變比例(約10％)高于亞洲人群(約3％)，但是，亞洲人群中巰嘌呤類藥物引起的白細胞減少癥的發生比例卻遠高于歐洲人群。最新研究表明，NUDT15基因的突變與巰嘌呤類藥物引起白細胞減少癥的相關性遠高于TMPT突變與該癥狀的相關性，NUDT15基因是不同人群中巰嘌呤類藥物引起白細胞減少癥的重要遺傳決定因素。

NUDT15基因位于人第13號染色體，具體位置為chr13:48611703-48621358(hg19)，基因全長9656bp。該基因共3個外顯子，編碼區長度為492bp，編碼蛋白為nudix水解酶15(nudix hydrolase 15)。NUDT15基因的外顯子第415位置(chr13:48619855(hg19))為一個SNP位點，正常情況下，415處的堿基為C(胞嘧啶)，415-417堿基CGT編碼的氨基酸為Arg(精氨酸)；發生突變后，415處的堿基變為T(胸腺嘧啶)，415-417堿基TGT編碼的氨基酸變為Cys(半胱氨酸)。NUDT15c.415CT突變為胚系突變，該突變在東亞人群最為常見(AF＝10.43％)，其次是拉丁美洲和南亞、歐洲芬蘭人，非洲人的突變頻率最低。

由于NUDT15基因c.415CT(p.Arg139Cys)突變增強了巰基嘌呤藥物誘導的白血球減少癥的易感性，因此，對于急性淋巴細胞性白血病、自身免疫性疾病(如克羅恩病、類風濕性關節炎)和器官移植病人，在服用巰基嘌呤藥物(Thiopurine)前檢測NUDT15基因突變點，確定NUDT15的基因型，有助于指導個體化用藥治療方案。

傳統的基因分型的方法有一代測序法、片段長度多態性法(限制性內切酶)、高分辨率熔解曲線法(HRM)和其他基于qPCR的方法。其中，一代測序法測序準確，但是操作步驟多，實驗周期長；片段長度多態性分析方法，需要酶切、電泳，容易造成樣本污染或酶切不充分；高分辨率熔解曲線法對儀器的溫度控制要求較高，適用性較低。尤其是目前市場上并沒有NUDT15基因分型的有效檢測產品，因此，設計專門的檢測NUDT15基因型的檢測產品具有十分重大的意義。

發明內容

基于此，有必要提供一種檢測效率高、特異性強且不易造成樣本污染的NUDT15基因分型用的引物、試劑盒和方法。

本發明解決上述技術問題的技術方案如下。

一種NUDT15基因分型用的引物，選自如下三組引物中的至少一組：