[發(fā)明專利]一種多物質(zhì)組合的煙草外植體防褐化方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201711331434.X
• 申請日: 2017-12-13
• 公開（公告）號: CN107926705A
• 公開（公告）日: 2018-04-20
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 向海英;蔣佳芮;許力;宋春滿;張建鐸;高茜;曾婉俐;張濤;鄧樂樂;陳章玉;李雪梅
• 申請（專利權(quán)）人: 云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 昆明正原專利商標(biāo)代理有限公司53100
• 代理人: 金耀生,亢能

1.一種多物質(zhì)組合的煙草外植體防褐化方法，其特征在于：包括如下步驟：

步驟（1），種子的消毒；

步驟（2），種子培養(yǎng)：將步驟（1）得到的種子接種到MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)，種子發(fā)芽長成幼苗；種子的培養(yǎng)條件為：在培養(yǎng)溫度為25±1℃，光照強度30-50μmol/(m²·s)，光照時間為16h/d的條件下培養(yǎng)60d；

步驟（3），煙草外植體培養(yǎng)：將步驟（2）中得到的幼苗，利用打孔器進行打孔得到煙草葉盤，將葉盤置于MS分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：28℃光照培養(yǎng)16h/d，光照強度30-50μmol/(m²·s)，25℃黑暗培養(yǎng)8h/d，培養(yǎng)5d，得到外植體；所述葉盤MS分化培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基中添加0.5mg/L的萘乙酸NAA、2mg/L的6-芐基腺嘌呤6-BA、30g/L蔗糖，4g/L的瓊脂，培養(yǎng)基的pH值為5.7；

步驟（4），防褐化培養(yǎng)：將步驟（3）中得到的外植體置于MS防褐化培養(yǎng)基中，在28℃光照培養(yǎng)16h/d，光照強度30-50μmol/(m²·s)，25℃黑暗培養(yǎng)8h/d的條件下培養(yǎng)40d，MS防褐化培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基中添加5-12.5g/L氯化鈣，2.5-7.5g/L D-異抗壞血酸鈉，1-4g/L檸檬酸、30g/L蔗糖和4g/L的瓊脂，培養(yǎng)基的pH值為5-6。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多物質(zhì)組合的煙草外植體防褐化方法，其特征在于：步驟（1）中，種子消毒的具體步驟為：取飽滿的煙草種子，然后移至超凈工作臺上，用75％酒精將種子浸泡30s，無菌水沖洗2遍，再用1％AgNO₃消毒10min，無菌水浸泡清洗5次，用無菌濾紙吸干外植體表面水分后進行接種，其中無菌水為經(jīng)高壓滅菌的超純水。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多物質(zhì)組合的煙草外植體防褐化方法，其特征在于：步驟（2）中，MS培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基中添加30g/L蔗糖和4g/L的瓊脂，培養(yǎng)基的pH值為5.7。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多物質(zhì)組合的煙草外植體防褐化方法，其特征在于：步驟（4）中，MS防褐化培養(yǎng)基的制備方法如下：

A、D-異抗壞血酸鈉的制備：稱取D-異抗壞血酸鈉溶于無菌水中，在超凈工作臺中使用濾頭過濾滅菌，制成濃度為50g/L的溶液；

B、檸檬酸的制備：稱取檸檬酸溶于無菌水中，在超凈工作臺中使用濾頭過濾滅菌，制成濃度為40g/L的溶液；

C、配制1L MS防褐化培養(yǎng)基：將MS基本培養(yǎng)基4.43g，30g蔗糖和1L超純水混合，并調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值為5.7；

D、防褐化培養(yǎng)基中添加防褐添加劑5-12.5g/L氯化鈣，4g瓊脂，121℃滅菌15min；

E、滅菌后，添加2.5-7.5g/L D-異抗壞血酸鈉，1-4g/L檸檬酸，搖勻，即得到MS防褐化培養(yǎng)基。