[發明專利]一種檢測miRNA-122的電化學生物傳感器

有效

• 申請號: 201711324299.6
• 申請日: 2017-12-13
• 公開（公告）號: CN108169311B
• 公開（公告）日: 2019-11-08
• 發明（設計）人: 黃加棟;裴倩倩;王玉;劉素
• 申請（專利權）人: 濟南大學
• 主分類號: C12Q1/682
• 分類號: C12Q1/682;C12Q1/6825;G01N27/48;G01N27/327
• 代理公司: 濟南泉城專利商標事務所 37218
• 代理人: 李桂存

本發明提供了一種檢測miRNA?122的電化學生物傳感器，包括HAP1（發卡探針1）、ExoIII酶（核酸外切酶III）、金電極和修飾于金電極表面的HAP2（發卡探針2）?輔助探針。本電化學生物傳感器特異性好、靈敏度高；反應條件溫和，反應速度快，使用金電極簡便、小型化、易攜帶、可多次使用；制備方法簡單，性能穩定，電極的重復性好，適用于人體組織中miRNA?122的檢測和生物傳感器產業化的實際應用。

技術領域

本發明屬于生物傳感器技術領域，特別涉及基于核酸外切酶Ⅲ檢測miRNA-122的電化學生物傳感器。

背景技術

MicroRNAs（miRNAs）是在真核生物中發現的一類內源性的具有調控功能的非編碼RNA，其大小長約20-25個核苷酸。miRNA-122，其核酸鏈堿基順序是5’-UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUG-3’。研究表明，miRNA-122 是由定位于人類第18號染色體上的HCR基因轉錄而來的，其不僅能夠影響肝細胞生長發育的過程，而且在肝細胞的表型、分化代謝以及細胞應答等諸多生命活動中也發揮著極其重要的作用。許多傳統的方法如Northern雜交，微陣列和聚合酶鏈式反應（PCR）已用以確定和量化miRNA。這些方法往往存在儀器昂貴、分析周期長、樣品預處理復雜、檢測費用昂貴、檢測靈敏度低等問題，已經難以滿足對miRNA進行方便、快捷、高靈敏檢測的要求。因此，快速，特異，等溫miRNA檢測新方法的研究是緊迫和嚴峻的。

發明內容

針對現有檢測方法中儀器操作復雜、耗時長和需要專業操作人員的缺點，提供了一種特異性強、靈敏度高、成本低和檢測速度快的基于核酸外切酶Ⅲ輔助的層疊信號放大的電化學生物傳感器用于miRNA-122的檢測。

本發明還提供了一種利用上述電化學生物傳感器檢測miRNA-122的方法。

為實現上述目的，本發明采用如下技術方案。

一種檢測miRNA-122的電化學生物傳感器，包括HAP1（發卡探針1）、ExoIII酶（核酸外切酶III）、金電極和修飾于金電極表面的HAP2（發卡探針2）-輔助探針；

所述HAP1的序列如SEQ No. 1所示；

HAP2的序列如SEQ No. 2所示，其5’端修飾二茂鐵（Fc），3’端修飾巰基（-SH）；所述發卡探針2通過Au-S鍵修飾于金電極表面；

輔助探針的序列如SEQ No. 3所示，其5’端修飾亞甲基藍（MB）；所述輔助探針通過與發卡探針2雜交修飾于金電極表面。

一種利用上述電化學生物傳感器檢測miRNA-122的方法，包括以下步驟：

（1）金電極拋光處理；

（2）將HAP2溶液滴加于金電極表面，37 ℃恒溫孵育；然后再滴加輔助探針溶液，37℃恒溫孵育；

（3）將HAP1、ExoIII與miRNA-122的標準溶液或待測液混合，37 ℃恒溫孵育；

（4）將步驟（3）的反應液滴加到步驟（2）所得的電極上，37 ℃恒溫孵育；然后漂洗；

（5）以Ag/AgCl為參比電極，以Pt電極為對電極，以步驟（4）所得金電極為工作電極，采用差分脈沖伏安法檢測讀取電信號的變化；

（6）根據標準溶液的電流變化作標準曲線，計算回歸方程，由待測液的電流變化，計算待測液中miRNA的濃度。

所述拋光處理為將金電極依次在0.3 μm和0.05 μm的氧化鋁漿中進行拋光至鏡面。

所述步驟（2）的HAP2和輔助探針的摩爾比為1:1。

步驟（5）中，電位設置為0到-0.5 V，脈沖寬度0.05 V，掃描速率0.06 s。