[發(fā)明專(zhuān)利]一種熒光互補(bǔ)檢測(cè)人趨化因子生物學(xué)活性的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201711296510.8
• 申請(qǐng)日: 2017-12-08
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN108191979B
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-01-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 周亞鳳;王緒德;申兆興;劉雪賓
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 上海晶諾生物科技有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C07K19/00
• 分類(lèi)號(hào): C07K19/00;C12N15/62;C12N15/85;C12N5/10;C12Q1/02;G01N33/68
• 代理公司: 廣州粵高專(zhuān)利商標(biāo)代理有限公司 44102
• 代理人: 馮振寧

本發(fā)明公開(kāi)了一種利用熒光互補(bǔ)檢測(cè)人趨化因子生物學(xué)活性的方法。一種用于檢測(cè)人趨化因子的生物學(xué)活性的融合蛋白組合，包括蛋白CXCR2?VC和蛋白β?Arrestin2?VN，蛋白CXCR2?VC的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，蛋白β?Arrestin2?VN的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。通過(guò)優(yōu)化黃色熒光蛋白Venus的拆分位點(diǎn)和linker序列的選擇，成功的構(gòu)建了用于檢測(cè)人趨化因子的生物學(xué)活性的融合蛋白組合。通過(guò)兩個(gè)重組載體分別轉(zhuǎn)化，克服了兩個(gè)重組載體共轉(zhuǎn)化本底熒光較強(qiáng)無(wú)法達(dá)到檢測(cè)目的的問(wèn)題。本發(fā)明構(gòu)建的融合蛋白組進(jìn)行趨化因子的活性檢測(cè)，簡(jiǎn)單易行，步驟簡(jiǎn)單，檢測(cè)效果好，結(jié)果可靠。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及一種熒光互補(bǔ)檢測(cè)人趨化因子生物學(xué)活性的方法。

背景技術(shù)

趨化因子是由多種細(xì)胞分泌的分子量在8-14kDa的可溶性蛋白，目前報(bào)道的趨化因子家族有48個(gè)成員，根據(jù)其蛋白氨基酸序列N端的色氨酸保守性可以分為C、CC、CXC、CX3C四類(lèi)。趨化因子受體是G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)，趨化因子與其受體結(jié)合后，可以激活腺苷酸環(huán)化酶、磷脂酶C等經(jīng)典的GPCR信號(hào)通路，調(diào)控cAMP、Ca2+水平，還可激活MAPK、PI3K及一些酪氨酸激酶信號(hào)通路，在免疫趨化、血管再生、創(chuàng)傷愈合、自身免疫、腫瘤發(fā)生等過(guò)程中起著重要的作用。現(xiàn)有的檢測(cè)趨化因子生物學(xué)活性的方法，要檢測(cè)細(xì)胞的趨化能力，一般需要用到Transwell小室，細(xì)胞受到梯度趨化因子刺激后穿過(guò)小室濾膜，黏附在膜的下面，染色并計(jì)數(shù)濾膜下表面的細(xì)胞數(shù)即可測(cè)出趨化因子的趨化能力，趨化活性常用的表示方法是趨化指數(shù)(chemotactic index，是指細(xì)胞遷移到待測(cè)樣品液的數(shù)目和遷移到對(duì)照液的數(shù)目的比值)，由于細(xì)胞類(lèi)型不同，趨化因子需要調(diào)整濃度來(lái)獲得比較好的趨向性，過(guò)程十分復(fù)雜。

熒光蛋白互補(bǔ)(Bimolecular fluorescence complementation，BiFC)主要是將一種熒光蛋白在合適氨基酸位點(diǎn)拆分為兩部分，把拆分后的蛋白分別與要研究的兩種目的蛋白融合，若目的蛋白能夠相互結(jié)合，會(huì)拉近兩個(gè)拆分的熒光蛋白并使得熒光蛋白結(jié)構(gòu)恢復(fù)成拆分前狀態(tài)，進(jìn)而通過(guò)不同波長(zhǎng)光激發(fā)，通過(guò)熒光顯微鏡檢測(cè)相對(duì)應(yīng)的熒光，方法直觀。這種技術(shù)已在有多種應(yīng)用，但是用于檢測(cè)趨化因子生物學(xué)活性的還鮮有報(bào)道。

CXCR2是GPCR受體家族的重要成員，它的配體趨化因子是CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8，這些趨化因子與CXCR2結(jié)合后會(huì)使CXCR2與β-Arrestin2蛋白結(jié)合，并激活下游的信號(hào)通路。CXCR2在癌癥的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中扮演著重要的角色，在患癌病人中的表達(dá)明顯提高，越來(lái)越多的研究表明CXCR2是治療癌癥的重要靶標(biāo)，如在橫紋肌肉瘤疾病模型中，抑制CXCR2引導(dǎo)的骨髓來(lái)源的抑制性細(xì)胞(Myeloid-derivedsuppressor cells，MDSCs)的遷移可以提高PD-1抗體治療腫瘤的效果。抑制CXCR2的功能還可以抑制急性和慢性胰腺炎(RJ，Sansom OJ，Morton JP，2015)等，抑制IL8-CXCR2信號(hào)通路能使白血病細(xì)胞系及骨髓增生細(xì)胞停滯在G0/G1期而對(duì)正常的造血干細(xì)胞沒(méi)有影響(Schinke C，Giricz O，2015)，由于CXCR2在疾病發(fā)生中的重要作用，CXCR2是治療疾病的重要靶點(diǎn)，開(kāi)發(fā)CXCR2抑制劑具有潛在的科研及應(yīng)用價(jià)值，如SB225002是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的CXCR2小分子抑制劑并被進(jìn)一步改造為SB265610和SB656933，Ha H等人用CXCR2配體相關(guān)的藥效模型進(jìn)行篩選了一批CXCR2的抑制劑(Ha H，Debnath B，2015)，但是這種方法需要檢測(cè)鈣信號(hào)、細(xì)胞增殖等，方法步驟上比較多，不是特別簡(jiǎn)單和直觀。

利用BiFC技術(shù)檢測(cè)趨化因子的生物學(xué)活性，將拆分的熒光蛋白片段與CXCR2、β-Arrestin2連接，在趨化因子存在下，CXCR2、β-Arrestin2空間上結(jié)合，促使拆分的熒光片段互補(bǔ)形成完整的熒光蛋白，可用熒光檢測(cè)，方法簡(jiǎn)單。同時(shí)構(gòu)建的細(xì)胞系還可用于CXCR2相關(guān)藥物研究，有很好的科研、商業(yè)價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容