[發明專利]一種蛋白質等電聚焦電泳方法及其配膠裝置

有效

• 申請號: 201711296232.6
• 申請日: 2017-12-08
• 公開（公告）號: CN107860814B
• 公開（公告）日: 2023-08-01
• 發明（設計）人: 曾娟梅;孫朗;扈會平;陳清華;徐曉;吳菊蓮;孫莉;鐘貞;曹珺
• 申請（專利權）人: 麗珠集團麗珠制藥廠
• 主分類號: G01N27/447
• 分類號: G01N27/447
• 代理公司: 廣州三環專利商標代理有限公司 44202
• 代理人: 溫旭

本發明公開了一種蛋白質等電聚焦電泳方法及其配膠裝置，屬于生物分離檢測技術領域。該方法包括配膠、灌膠、預電泳、電泳、以及凝膠固定、脫色、染色等步驟，本發明的方法通過改變樣品的上樣方式和預電泳與電泳的電壓和電泳時間，使得得到的蛋白質電泳條帶清晰、分離度好、不擴散不拖尾，有效解決了現有技術電泳時間長、蛋白擴散拖尾等問題，大大提高了配膠成功率。本發明的配膠裝置包括配膠支架、固定架、配膠玻璃、墊片和防漏墊等部件，本發明通過改良配膠裝置的結構，不僅使得試劑消耗量降低，而且灌膠迅速且不產生氣泡，聚膠均勻，大大提高了配膠成功率的同時還降低了檢驗成本。

技術領域

本發明涉及生物分離檢測技術領域，具體涉及一種蛋白質等電聚焦電泳方法及其配膠裝置。

背景技術

等電聚焦電泳(IEF)是兩性電解質在電泳場中(常用聚丙烯酰胺凝膠)形成一個pH梯度，由于蛋白質為兩性物質，其所帶電荷與介質的pH值有關，帶電的蛋白質在電泳中向極性相反的方向遷移，當遷移到達其等電點(PI)的pH處，此時，該蛋白質不再帶有凈的正或負的電荷，電流達到最小，不再移動，形成一個很窄的區帶，從而達到檢測蛋白質類和肽類供試品等電點的電泳方法。目前，常規的等電聚焦電泳方法存在以下問題：1、IEF電泳常出現蛋白擴散、拖尾、燒膠等不良現象，需增加檢驗次數，耗時長，造成人力財力物力浪費；2、現有的IEF配膠裝置配膠面積大，灌膠易產生氣泡，聚膠不均，膠薄易裂，操作難度大，成功率低，多次配膠造成耗材嚴重浪費；3、目前IEF的配膠裝置膠墊僅為0.3mm，配膠操作難度大，難以一次性成功，導致每次檢驗至少有50％的膠面積被浪費，加上配膠試劑昂貴，由此造成IEF檢驗成本居高不下。

發明內容

為了克服現有技術的不足，本發明的目的在于提供一種蛋白質等電聚焦電泳方法及其配膠裝置，通過該方法得到的蛋白質電泳條帶清晰、分離度好、不擴散不拖尾，有效解決了現有技術電泳時間長、蛋白擴散拖尾等問題，大大提高了配膠成功率。

為解決上述問題，本發明所采用的技術方案如下：

一種蛋白質等電聚焦電泳方法，其包括以下步驟：

A、配膠、灌膠：將30％丙烯酰胺溶液、兩性電解質溶液和純化水混合后，用超聲波脫氣5～10min；灌膠前加入10％過硫酸銨和TEMED，混勻后向配膠裝置的配膠玻璃灌膠；

B、預電泳：凝膠聚合后清除玻璃板上的殘膠，將膠貼在薄玻璃片上，膠與玻璃片之間不能有氣泡，將貼有凝膠的薄玻璃片放在溫度為8～12℃的冷卻板上，當凝膠的溫度到達8～12℃時，在凝膠左邊放上用負極液潤濕的電極條，右邊放上用正極液潤濕的電極條，將電極對準電極條的中心，正極與負極分別與電泳槽的正、負極連接，蓋上安全罩，將正、負極與電源連接，進行預電泳，預電泳電壓為100V，預電泳時間為10min；

C、電泳：預電泳結束后，取下電極板，用微量移液器直接加供試品溶液2～3μl，標準品上樣量為2～3μl，加供試品后按預電泳步驟操作，電泳電壓為900～1000V，電泳時間為40min；當標準品有色條帶移至電極條邊時，停止電泳；

D、固定：取出凝膠，先將凝膠固定至少20min，然后滴加脫色液脫色20～30min，再滴加染色液染色40～60min，再滴加脫色液脫色直至背景無色后，將凝膠浸泡在保存液中，采用凝膠掃描儀分析等電點，做成干膠永久保存。

作為本發明優選的實施方式，所述步驟B中的負極液為0.2mol/L氫氧化鈉溶液，正極液為0.5mol/L磷酸溶液。

作為本發明優選的實施方式，所述步驟D中的固定液為三氯醋酸、磺基水楊酸與純化水的混合溶液，脫色液為乙醇、冰醋酸和純化水的混合溶液，染色液為考馬斯亮藍G250與脫色液的混合溶液。

作為本發明優選的實施方式，所述步驟D中的保存液是由甘油和脫色液組成混合溶液。