[發(fā)明專利]一種基于CRISPR/Cas9技術(shù)介導(dǎo)絨山羊VEGF基因定點(diǎn)敲入的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201711272376.8
• 申請(qǐng)日: 2017-12-06
• 公開（公告）號(hào): CN108570479B
• 公開（公告）日: 2020-04-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 梁紅宇;劉東軍;梁浩;呼嘯;王輝;王志剛
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 內(nèi)蒙古大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/90
• 分類號(hào): C12N15/90;C12N15/85;C12N15/877;A01K67/027
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

1.一種基于CRISPR-Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)絨山羊VEGF基因定點(diǎn)敲入的方法，其特征在于，其是根據(jù)絨山羊的CCR5基因序列，構(gòu)建基于CRISPR-Cas9系統(tǒng)的gRNA表達(dá)載體和VEGF同源重組載體，然后將優(yōu)化后的CRISPR-Cas9載體和上述構(gòu)建的gRNA表達(dá)載體及VEGF同源重組載體共同轉(zhuǎn)入絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞中，獲得VEGF基因定點(diǎn)敲入的細(xì)胞；

所述絨山羊?yàn)榘柊退菇q山羊；

靶位點(diǎn)在安全位點(diǎn)CCR5基因的第2外顯子上，gRNA靶序列為5’-GTCTTCTTCTCGCTGCGACAC-3’；

所述CRISPR-Cas9載體的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；

所述gRNA表達(dá)載體的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；

所述VEGF同源重組載體的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。

2.權(quán)利要求1所述方法獲得的絨山羊VEGF基因定點(diǎn)敲入的細(xì)胞系。

3.權(quán)利要求1所述方法在生產(chǎn)VEGF基因定點(diǎn)敲入的克隆絨山羊中的應(yīng)用，所述絨山羊?yàn)榘柊退菇q山羊。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，絨山羊VEGF基因定點(diǎn)敲入的細(xì)胞為核移植供體細(xì)胞，離體的絨山羊卵母細(xì)胞為核移植受體細(xì)胞，通過(guò)核移植技術(shù)獲得絨山羊克隆胚胎，然后將克隆胚胎通過(guò)胚胎移植技術(shù)移入絨山羊子宮內(nèi)妊娠，獲得VEGF基因定點(diǎn)敲入的絨山羊。