[發(fā)明專利]精子活性氧類物質(zhì)定量測(cè)定試劑盒及其用途和使用方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201711269951.9
• 申請(qǐng)日: 2017-12-05
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN108132213A
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-06-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 胡家純;陶思恩;趙毅;劉少栩;楊紅芳;程浩
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 深圳市博銳德生物科技有限公司
• 主分類號(hào): G01N21/01
• 分類號(hào): G01N21/01;G01N21/78;G01N21/31
• 代理公司: 深圳市中知專利商標(biāo)代理有限公司 44101
• 代理人: 張學(xué)群

1.一種活性氧定量檢測(cè)試劑盒，其特征在于，包括氯化硝基四氮唑藍(lán)凍干粉、氯化硝基四氮唑藍(lán)溶解液、顯色劑A、顯色劑B、標(biāo)準(zhǔn)品；

所述氯化硝基四氮唑藍(lán)凍干粉是濃度為0.1～1mmol/L的氯化硝基四氮唑藍(lán)藥液冷凍干燥后的粉末；所述氯化硝基四氮唑藍(lán)溶解液是濃度為0.01～0.5mol/L、pH為7.2～7.6的磷酸鹽緩沖液；所述顯色劑A是濃度為0.01～0.3mol/L的弱酸性緩沖液；所述顯色劑B是0.01％～2％三乙醇胺溶液；所述標(biāo)準(zhǔn)品為含有已知濃度為0～36mmol/L的過(guò)氧化氫溶液。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種活性氧定量檢測(cè)試劑盒，其特征在于，還包括微孔板條；所述氯化硝基四氮唑藍(lán)凍干粉為分裝于密封容器的多瓶，所述顯色劑A、顯色劑B、標(biāo)準(zhǔn)品分別獨(dú)立裝于瓶中。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種活性氧定量檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述顯色劑A為碳酸氫鈉溶液或醋酸鈉或磷酸二氫鉀或檸檬酸緩沖液。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種活性氧定量檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述氯化硝基四氮唑藍(lán)藥液的濃度為0.212mmol/L；所述氯化硝基四氮唑藍(lán)溶解液是濃度為0.05mol/L的磷酸鹽緩沖液；所述顯色劑A是濃度為0.25mol/L的碳酸氫鈉溶液；所述顯色劑B的濃度是1.62％的三乙醇胺溶液；所述標(biāo)準(zhǔn)品是濃度為36mmol/L的過(guò)氧化氫溶液。

5.一種活性氧定量檢測(cè)試劑盒的用途，其特征在于，用于檢測(cè)成年男性精子活性氧類物質(zhì)的含量。

6.一種使用權(quán)利要求1所述活性氧定量檢測(cè)試劑盒檢測(cè)精子活性氧的方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟一，將所取新鮮精液標(biāo)本進(jìn)行前處理，精子濃度記為M×10⁶/mL；

步驟二，將氯化硝基四氮唑藍(lán)溶液分為兩大組，第一組加入精液濃度為M的洗滌精液標(biāo)本，第二組分別依次加入多個(gè)已知過(guò)氧化氫濃度C_{標(biāo)準(zhǔn)}的標(biāo)準(zhǔn)品，混勻；其中，氯化硝基四氮唑藍(lán)溶液與洗滌精液標(biāo)本的體積比為1～10。

步驟三，將所述步驟一中所得第一組和第二組反應(yīng)液在10～40℃溫度下反應(yīng)1min，分別讀取第一組和第二組的反應(yīng)液在630nm波長(zhǎng)下的第一次吸光度；然后，反應(yīng)液在10～40℃溫度下繼續(xù)反應(yīng)10～120min；

步驟四，在所述步驟二中所得第一組和第二組反應(yīng)液內(nèi)分別加入顯色劑A，混勻；其中，顯色劑A與洗滌精液標(biāo)本的體積比為0.2～3。

步驟五，在所述步驟三中所得第一組和第二組反應(yīng)液內(nèi)加入顯色劑B，混勻；其中，顯色劑B與去洗滌精液標(biāo)本的體積比為0.2～3。

步驟六，將所述步驟四中所得第一組和第二組反應(yīng)液在10～40℃溫度下反應(yīng)1min，分別讀取第一組和第二組的反應(yīng)液在630nm波長(zhǎng)下的第二次吸光度；然后，反應(yīng)液在10～40℃溫度下繼續(xù)反應(yīng)10～120min；

步驟七，分別以第一組和第二組的第二次吸光度減去各自的第一次吸光度，分別記為精液標(biāo)本中參與反應(yīng)的活性氧吸光度△A_{標(biāo)本}和標(biāo)準(zhǔn)品中參與反應(yīng)的活性氧吸光度△A_{標(biāo)準(zhǔn)}；

步驟八，計(jì)算得出精子活性氧的水平C_{標(biāo)本}。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述一種檢測(cè)精子活性氧的方法，其特征在于，所述步驟二中，所述標(biāo)準(zhǔn)品是使用濃度為36mmol/L的過(guò)氧化氫溶液和純水配制成濃度為0、2.25mmol/L、4.5mmol/L、9mmol/L、18mmol/L、36mmol/L的六個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品。

8.根據(jù)權(quán)利要求6所述一種檢測(cè)精子活性氧的方法，其特征在于，所述步驟三或步驟六中，反應(yīng)液的反應(yīng)溫度是37℃；讀取吸光度數(shù)值后，反應(yīng)液在37℃溫度下繼續(xù)反應(yīng)45min。

9.根據(jù)權(quán)利要求6所述一種檢測(cè)精子活性氧的方法，其特征在于，所述氯化硝基四氮唑藍(lán)溶液與洗滌精液標(biāo)本的體積比為2；所述氯化硝基四氮唑藍(lán)溶液與標(biāo)準(zhǔn)品的體積比為10；所述顯色劑A與洗滌精液標(biāo)本的體積比為0.6；顯色劑B與去洗滌精液標(biāo)本的體積比為0.6。

10.根據(jù)權(quán)利要求6所述一種檢測(cè)精子活性氧的方法，其特征在于，所述步驟八中，分別得到六個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品相應(yīng)的△A_{標(biāo)準(zhǔn)}擬合成校準(zhǔn)曲線，讀取△A_{標(biāo)本}的值在校準(zhǔn)曲線上對(duì)應(yīng)的濃度值并除以標(biāo)本的稀釋倍數(shù)，即為精子活性氧的水平C_{標(biāo)本}；精子ROS量＝精子ROS濃度÷精子濃度。