[發明專利]產生和篩選DNA編碼的庫的方法

有效

• 申請號: 201711269685.X
• 申請日: 2010-02-16
• 公開（公告）號: CN107916456B
• 公開（公告）日: 2021-08-10
• 發明（設計）人: 理查德·W·瓦格納
• 申請（專利權）人: X-化學有限公司
• 主分類號: C40B40/08
• 分類號: C40B40/08;C40B50/06;C40B70/00
• 代理公司: 北京康信知識產權代理有限責任公司 11240
• 代理人: 沈敬亭;李海霞

本申請提供了產生和篩選DNA編碼的庫的方法。本發明的特征在于用于識別結合于生物靶的一種或多種化合物的許多方法。該方法包括合成化合物的庫，其中化合物包含具有一個或多個多樣性位置的功能部分。化合物的功能部分可操作地連接于識別功能部分結構的起始寡核苷酸。

本申請是申請日為2010年2月16日的題為“產生和篩選DNA編碼的庫的方法”的中國專利申請No.201080007813.3的分案申請。

技術領域

本發明涉及產生和篩選DNA編碼的庫的方法。

背景技術

藥物開發的迅速增長的成本已導致持續探索盡可能廉價地篩選更大化學空間的新方法以發現具有更高效能以及很少毒性至沒有毒性的分子。在二十世紀八十年代組合化學方式最初被譽為是超越藥物開發范式的方法，但在很大程度上是失敗的，這是由于庫大小不足以及不適當的去卷積方法。最近，小分子的DNA顯示組合庫的使用已產生用于篩選治療性前導化合物的新范式轉變。

Morgan等人(美國專利申請公開號2007/0224607，以引用方式結合于本文)確定了在藥物開發中使用DNA-顯示組合方式的主要挑戰：(1)足夠復雜性的庫的合成以及(2)在所使用的篩選中具有活性的分子的鑒定。另外，Morgan等人說明了，庫的復雜性程度越高，即，存在于庫中的不同結構的數目越高，則庫包含具有感興趣活性的分子的可能性就越大。因此，在庫合成中采用的化學性能必須能夠在合理的時間框架內產生大量化合物。在識別具有不同化學型和高親和力的分子時，這種方式通常是成功的。然而，關于產生巨大復雜性的庫以及在已描述的規模上評估測序輸出，則已顯露許多問題。例如，在多重化學轉化(例如，通常為3個或4個步驟)和生物轉化(例如，DNA標記的酶促連接)以后庫的純化是麻煩的并且導致在庫中的大量的“噪聲”，這是由于分子的不完全合成或由于在連接步驟期間的錯標記。此外，為查詢所選擇群體所需要的測序量是驚人的，通常需要“下一代”測序方法。后者是由于以下事實：需要嵌入庫的DNA部分中的復雜的遺傳標記方案、以及用于分析“下一代”測序輸出的生物信息學算法以通過噪聲篩選和確定庫中的擊中(采樣，hits)。因此，甚至使用這些方法，仍然沒有足夠推進測序以從給定篩選中完全捕獲序列的多樣性(表示真正擊中和“噪聲”兩者)。

組合小分子庫的DNA顯示依賴于庫的多步的、分離-和-合并合成，其結合(偶聯，偶合)于DNA標記的酶加成，其中上述DNA標記編碼所使用的合成步驟和結構單元(標準部件，building block)。通常進行和編碼許多(例如，3個或4個)合成步驟，并且這些合成步驟包括多樣性位置(本文描述為A、B、以及C(圖1))，如那些通過將具有例如胺或羧酸酯官能團的結構單元結合到化學骨架上所形成的多樣性位置，其中化學骨架顯示在限定方向上的連接的結構單元。經常用于組合庫中的骨架(S)的一個實例是三嗪部分，其可以在它的環狀結構周圍的三個位置中正交衍生。

庫形成過程可以是費時的，產物經常被未有效純化，以及結果是可以發生未知反應，其會產生連接于DNA的不想要的和/或未知的分子。此外，庫的不完全純化可以導致在連接步驟期間的標記交叉污染，從而導致錯標記。用于從庫中篩選和測序擊中的最終結果是，必須采用大規模并行測序，這是由于連接于意外的分子(例如，未反應的或副產物)的DNA或錯標記的DNA固有的“噪聲”。因此，會損失測序的效率。

在一些情況下，從其構建小分子庫的起始寡核苷酸(initiatoroligonucleotide)，包含以共價封閉、雙鏈寡核苷酸形式的用于聚合酶擴增(例如，PCR)的引物結合區。對于進行聚合酶反應來說，這種構建物是很成問題的，這是由于難以解鏈雙鏈體以及難以使引物寡核苷酸結合和引發聚合作用，其導致無效反應，從而降低產率10至1000倍或更大。

需要更多分步方式以篩選和識別具有更高效能以及很少毒性至沒有毒性的小分子。

發明內容