[發(fā)明專(zhuān)利]熒光素酶報(bào)告基因法豬干擾素α生物學(xué)活性檢測(cè)方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201711264195.0
• 申請(qǐng)日: 2017-12-05
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107841529A
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-03-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 趙俊;王明麗;甘霖;王利利;趙雨;梅志強(qiáng);蔣敏之
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 安徽九川生物科技有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/66
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/66;G01N21/64
• 代理公司: 北京科家知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙)11427
• 代理人: 陳娟

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種熒光素酶報(bào)告基因法豬干擾素α生物學(xué)活性檢測(cè)方法，屬于干擾素活性檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

干擾素α廣泛應(yīng)用于抗病毒感染和免疫功能障礙方面的疾病治療，其作為一種細(xì)胞因子通過(guò)與靶細(xì)胞表明的特定受體結(jié)合引起細(xì)胞內(nèi)系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活，表現(xiàn)出抗病毒作用或免疫調(diào)節(jié)作用。目前干擾素α在細(xì)胞內(nèi)起作用的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑已經(jīng)研究的比較透徹，主要是通過(guò)激活JAK-STAT信號(hào)級(jí)聯(lián)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。干擾素α與受體結(jié)合激活受體相關(guān)JAK1和TYK2，使STAT1和STAT2絡(luò)氨酸磷酸化，磷酸化的STAT1和STAT2形成二聚體并轉(zhuǎn)移入核，裝配干擾素調(diào)節(jié)因子9(IRF9)形成3聚體的干擾素刺激因子3(ISGF3)。ISGF3與其同源DNA序列(干擾素刺激反應(yīng)原件，ISREs)結(jié)合，直接激活干擾素刺激基因(ISGs)轉(zhuǎn)錄，使宿主細(xì)胞進(jìn)入抗病毒狀態(tài)。ISG抑制病毒的途徑主要有，抑制病毒的轉(zhuǎn)錄、翻譯和核酸復(fù)制；降解病毒核酸；改變宿主細(xì)胞脂代謝。因此，只要檢測(cè)到ISGs的啟動(dòng)子活性增加就可以直接反應(yīng)干擾素α的生物學(xué)活性。

Mx蛋白(Mx prorein)是主要的ISGs，干擾素α可以經(jīng)JAK-STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活Mx啟動(dòng)子(Mx promoter，pMx)，促進(jìn)Mx的表達(dá)，Mx能夠抑制負(fù)鏈RNA病毒復(fù)制。在豬中存在Mx1和Mx2兩種蛋白，其中Mx1起主要作用。pMx有較好的專(zhuān)一性，它不能被白細(xì)胞介素(Interleukin)、腫瘤壞死因子(Tumor Necrosis Factor，TNF)等其它細(xì)胞因子啟動(dòng)。

目前檢測(cè)干擾素生物學(xué)活性主要有3種方法，病毒復(fù)制抑制、噬斑減少分析和細(xì)胞病變抑制。但這3種方法都容易產(chǎn)生較大誤差，重復(fù)性不好，精確度低。作為改進(jìn)，隨后用表達(dá)GFP的重組VSV病毒替代野生型VSV病毒，可以通過(guò)熒光蛋白的表達(dá)來(lái)反映病毒感染復(fù)制的數(shù)量程度，進(jìn)而判定IFN對(duì)病毒復(fù)制的抑制程度，敏感性和重復(fù)性顯著改善，但仍然存在檢測(cè)過(guò)程耗時(shí)過(guò)長(zhǎng)、不便于大通量樣品檢測(cè)、敏感性不夠理想及活病毒生物安全隱患等諸多不足。

發(fā)明內(nèi)容

鑒于上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，本發(fā)明的目的是提供一種利用熒光素酶報(bào)告基因(luc)檢測(cè)豬干擾素α生物學(xué)活性的方法，能夠簡(jiǎn)化檢測(cè)過(guò)程，不需要重復(fù)進(jìn)行病毒培養(yǎng)或質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的繁瑣操作，提高準(zhǔn)確性和重復(fù)性，避免了可能存在的生物安全危害。

本發(fā)明的目的通過(guò)以下技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)：

一種熒光素酶報(bào)告基因法豬干擾素α生物學(xué)活性檢測(cè)方法，其包括以下步驟：

采用PCR擴(kuò)增獲取豬Mx1蛋白的pMx1的基因片段；

將PCR擴(kuò)增獲得的豬Mx1蛋白的pMx1的基因片段插入pGL3-basic載體luc基因的5'端，再采用PCR擴(kuò)增得到pMx1-luc融合基因片段；

用pMx1-luc融合基因片段替代pEGFP-N1載體中的pCMV和EGFP的基因片段，構(gòu)建pMx1-luc質(zhì)粒；

用pMx1-luc質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，并通過(guò)新霉素篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株；

對(duì)篩選出的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株進(jìn)行克隆化培養(yǎng)；

以梯度稀釋的豬干擾素α標(biāo)準(zhǔn)品制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定干擾素效價(jià)與熒光值之間的數(shù)學(xué)邏輯關(guān)系；

將待檢豬干擾素α樣品加入克隆化培養(yǎng)后的細(xì)胞中，然后檢測(cè)熒光強(qiáng)度，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線評(píng)價(jià)待檢豬干擾素α樣品的效價(jià)。

上述的熒光素酶報(bào)告基因法豬干擾素α生物學(xué)活性檢測(cè)方法中，將待檢豬干擾素α樣品加入克隆化培養(yǎng)后的細(xì)胞中，需要孵育一定的時(shí)間，一般6小時(shí)左右。

本發(fā)明中，pMx1是指豬Mx1基因啟動(dòng)子區(qū)域，pCMV是指pEGFP-N1質(zhì)粒的CMV啟動(dòng)子區(qū)域。

上述的熒光素酶報(bào)告基因法豬干擾素α生物學(xué)活性檢測(cè)方法中，優(yōu)選的：

pMx1的基因片段序列為序列1所示；

pMx1-luc融合基因片段序列為序列2所示。

上述的熒光素酶報(bào)告基因法豬干擾素α生物學(xué)活性檢測(cè)方法中，優(yōu)選的，采用PCR擴(kuò)增獲取豬Mx1蛋白的pMx1的基因片段的步驟包括：

根據(jù)Genebank中已公布的豬Mx1蛋白的基因序列，選擇5'端含有ISRE反應(yīng)元件的啟動(dòng)子區(qū)域，設(shè)計(jì)PCR引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物pMx1基因片段；

將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切，再通過(guò)切膠回收純化獲得pMx1的基因片段。

上述的熒光素酶報(bào)告基因法豬干擾素α生物學(xué)活性檢測(cè)方法中，優(yōu)選的，采用PCR擴(kuò)增獲取豬Mx1蛋白的pMx1的基因片段將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切的步驟中選用的酶為KpnI和HindIII。