[發明專利]一種沙棘屬植物根瘤內生菌分離培養方法

在審

• 申請號: 201711258256.2
• 申請日: 2017-12-04
• 公開（公告）號: CN107699531A
• 公開（公告）日: 2018-02-16
• 發明（設計）人: 張愛梅;韓雪英
• 申請（專利權）人: 西北師范大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N1/02;C12R1/41
• 代理公司: 蘭州智和專利代理事務所(普通合伙)62201
• 代理人: 張英荷

技術領域

本發明涉及一種植物根瘤內生菌的分離培養方法，尤其涉及一種沙棘屬植物根瘤內生菌的分離培養方法，屬于微生物分離培養技術領域。

背景技術

植物內生菌（Endophyte）是在一定階段或全部階段生活于健康植物的組織和器官內部的一大類微生物，他們能與植物形成寄生、共生、腐生等關系。研究發現，不僅從各種植物中可以分離得到內生菌，而且在同一種植物的根、莖、葉、花、果實和種子等中均有內生菌被發現。內生菌數量龐大，種類眾多，包括內生真菌、內生細菌和內生放線菌等。植物內生菌具有豐富的生物多樣性，對于一種植物而言，從中可分離到的內生真菌或細菌通常為幾種至幾十種，有的甚至可達幾百種。植物內生菌也是一種具有潛在應用價值的新的微生物資源，從植物內生菌中尋找新的生物活性物質成為研究的熱點。

沙棘是一種灌木或喬木，為胡頹子科沙棘屬的放線菌結瘤植物。有學者用可培養的方法研究了野生沙棘健康的根、莖、葉組織中的內生菌，發現沙棘內生菌具有豐富的多樣性。為了探明沙棘根瘤內是否存在多樣的內生菌，需要展開進一步的資源調查，收集盡可能多的不同宿主來源的菌株，積累豐富的形態、生理和生化指標，建立和豐富沙棘屬植物根瘤內生菌菌株資源庫數據庫。

對于內生菌多樣性的研究，傳統的方法主要是應用微生物培養技術，從特定的樣品中通過分離、培養等獲得微生物的純培養物，再進行菌株的分類鑒定。但由于培養基與自然環境之間的營養差異較大，所以無法模擬沙棘根瘤內生菌棲息地的原有條件，大量微生物無法培養。傳統方法在分離培養沙棘根瘤內生菌時，分別采用PDA培養基、牛肉膏蛋白胨培養基和高氏I號培養基等，平板上分離到的內生菌種類和數量較少，不能充分地反映整個植物體內生菌的數量和種類。

發明內容

本發明的目的是一種沙棘屬植物根瘤內生菌的分離培養方法，以期得到大量的菌種資源，為以后更進一步的開展內生菌相關研究提供材料。

沙棘根瘤大小、顏色和形狀等都會因為沙棘種類的不同，以及沙棘生長生境和時間的不同而有所變化。因此，選取新鮮幼嫩的沙棘根瘤，對沙棘根瘤樣品進行表面消毒后，采用根瘤切片法和平板分離法，在不同的培養基上進行不同種類沙棘根瘤內生菌的分離培養。其具體工藝如下：

（1）對沙棘根瘤樣品進行表面消毒：取備用的沙棘根瘤樣品，依次用流動的自來水沖洗，并用毛筆刷洗掉泥沙等雜質后，用無菌水沖洗3~5次，用75%乙醇表面消毒8~10min、用1%NaClO溶液表面消毒5~7min，再用無菌水沖洗3~5次（在整個操作過程中避沙棘根瘤樣品表面破損）。

（2）內生菌培養分離：將經消毒處理的沙棘根瘤切片，分別置于不同平板上培養基上，采用不同的培養基，并加入沙棘根浸出液，進行無菌培養，培養溫度為25~30℃，培養時間為 3~7d；內生真菌采用PDA培養基，內生細菌采用牛肉膏蛋白胨培養基，內生放線菌采用高氏I號培養基。培養基與沙棘根浸出液的體積比為1:15~1:20。

上述沙棘根浸出液的制備方法：將沙棘根洗凈剪碎，與蒸餾水按1:1~1:1.5的體積比混合，煮沸后文火煎煮0.5~1h，過濾，取清液，121℃滅菌儲存備用。

（3）內生菌的純化：待組織塊邊緣長出菌落后轉接至新鮮的平板，通過劃線純化，即得內生菌單菌落。

本發明相對現有技術具有以下優點：在沙棘根瘤內生菌分離時，培養基中加入沙棘根浸出液后的培養基更加接近內生菌生長的原始營養條件，更適合內生菌的生長。在分離內生菌的過程中，根瘤切片周圍很快鋪滿生長較快的內生菌菌苔；并且在后期菌株的擴大培養中，加入沙棘根浸出液的培養基也能顯著促進菌株的生長，顯著增加了可培養根瘤內生菌菌株的種類和數量，獲得更多的內生菌資源，并且可以縮短內生菌分離培養的時間。

附圖說明

圖1為未加沙棘根浸出液的沙棘根瘤內生菌培養圖（左）及添加沙棘根浸出液的沙棘根瘤內生菌培養圖（右）。

具體實施方式

下面通過具體實施例對本發明沙棘根瘤內生菌培養分離的方法及效果做進一步說明。

實施例1

（1）對沙棘根瘤樣品進行表面消毒

選取新鮮幼嫩的沙棘根瘤，對沙棘根瘤樣品進行表面消毒：取備用的沙棘根瘤樣品，依次用流動的自來水沖洗，并用毛筆刷洗掉泥沙等雜質后，用無菌水沖洗3~5次，用75%乙醇表面消毒8~10min、用1%NaClO溶液表面消毒5~7min，再用無菌水沖洗3~5次（在整個操作過程中避沙棘根瘤樣品表面破損）。

（2）內生菌的分離培養