[發明專利]一種體外誘導抗原特異性T細胞的方法

在審

• 申請號: 201711252131.9
• 申請日: 2017-12-01
• 公開（公告）號: CN108004208A
• 公開（公告）日: 2018-05-08
• 發明（設計）人: 呂凌;古鑒
• 申請（專利權）人: 南京愛瑞生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783
• 代理公司: 南京蘇創專利代理事務所(普通合伙) 32273
• 代理人: 蔣真

1.一種體外誘導抗原特異性T細胞的方法，其特征在于包括以下步驟：

步驟一，采血：采用肝素抗凝常規采血手段采集血液；

步驟二，分離：從采集到的血液中離心分離出外周淋巴細胞，再由外周血淋巴細胞分離得到原始CD4+CD45RA+T細胞；

步驟三，準備DC細胞：使用CD14標記流式分選DC細胞，并用粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)與白細胞介素-4(il-4)預處理DC細胞；

步驟四，第一次擴增T細胞：使用輻照處理的所述步驟三中的DC細胞激活T細胞；

步驟五，第二次擴增T細胞：第11天根據細胞濃度，再次加入輻照處理的DC細胞、白細胞介素-2(IL-2)、白細胞介素-15(IL-15)和轉化生長因子-β(TGF-β)對所述步驟四中的T細胞重新刺激，促進T細胞的再次激活擴增，培養至細胞數達到目的擴增量，收集細胞，得到CD4+CD25+調節性T細胞。

2.根據權利要求1所述的體外誘導抗原特異性T細胞的方法，其特征在于所述步驟三包括如下步驟：選用HLA表型且與所述步驟二中得到的原始CD4+CD45RA+T細胞相異的供者的血液對其經過淋巴細胞分離液分離后,分選得到CD14+細胞，并使用濃度為1000U/ml的粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF),以及濃度為1000U/ml白細胞介素-4(il-4)對所述CD14+細胞刺激6天，分選得到DC細胞，在擴增之前，分選后的DC細胞加入抗原肽刺激成熟，并于誘導與擴增T細胞的當天，進行輻照當量為30Gy的輻照處理。

3.根據權利要求1所述的體外誘導抗原特異性T細胞的方法，其特征在于：所述步驟四包括如下步驟：對所述步驟二中分選所得的所述CD4+CD45RA+T細胞進行刺激，加入所述步驟三中經輻照處理的DC細胞、白細胞介素-2(IL-2)、白細胞介素-15(IL-15)和轉化生長因子-β(TGF-β)培養11天，每三天計算細胞數，并根據細胞密度分盤，補充培養基。

4.根據權利要求3所述的體外誘導抗原特異性T細胞的方法，其特征在于：所述步驟四中，所述培養基由完全RPMI-1640培養基中添加濃度100U/ml的青霉素、濃度100μg/ml的鏈霉素、摩爾濃度2mM的左旋谷氨酸、摩爾濃度10mM 4-的羥乙基哌嗪乙磺酸、摩爾濃度0.1mM的非必須氨基酸、摩爾濃度1mM的丙酮酸鈉和摩爾濃度50mΜ的二羥基乙醇配制而成。

5.根據權利要求1所述的體外誘導抗原特異性T細胞的方法，其特征在于：所述步驟四中第一次擴增T細胞的方式為T細胞表面受體刺激，通過DC細胞進行T細胞表面受體刺激，調節性T細胞與DC細胞比例為10:1，由于DC細胞經過輻照處理，因此將于5天后，死亡殆盡；所述的刺激劑包括濃度為100U/ml的白細胞介素-2(IL-2)、濃度為10ng/ml的白細胞介素-5(IL-15)、濃度為100ng/ml的轉化生長因子-β(TGF-β)以及摩爾濃度為10nM的雷帕霉素(rapamycin)；每三天計算細胞數，并增加培養基，從而保持細胞濃度在0.5X106/ml,同時需重新加入足量的白細胞介素-2(IL-2)，并適量加入雷帕霉素(rapamycin)以維持其濃度。

6.根據權利要求1所述的體外誘導抗原特異性T細胞的方法，其特征在于：所述步驟五中第二次擴增T細胞的方式為T細胞表面受體刺激，通過DC細胞進行T細胞表面受體刺激，調節性T細胞與DC細胞比例為10:1，由于DC細胞經過輻照處理，因此將于5天后，死亡殆盡；所述的刺激劑包括濃度為100U/ml的白細胞介素-2(IL-2)、濃度為10ng/ml的白細胞介素-5(IL-15)、濃度為100ng/ml的轉化生長因子-β(TGF-β)以及摩爾濃度為10nM的雷帕霉素(rapamycin)；每三天計算細胞數，并增加培養基，從而保持細胞濃度在0.5X106/ml,同時需重新加入足量的白細胞介素-2(IL-2)，并適量加入雷帕霉素(rapamycin)以維持其濃度。