[發(fā)明專利]一種重組黑曲霉果膠酶及編碼基因和制備與應用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201711246814.3
• 申請日: 2017-12-01
• 公開（公告）號: CN109868266A
• 公開（公告）日: 2019-06-11
• 發(fā)明（設計）人: 尹恒;譚海東;陳瑋;劉啟順;王文霞
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: C12N9/18
• 分類號: C12N9/18;C12N9/24;C12N9/88;C12N15/55;C12N15/56;C12N15/60;C12N15/81;C12P19/02;C12P19/12;C12P19/04;C12P19/14
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 馬馳

本發(fā)明提供了一種重組黑曲霉(Aspergillus niger)果膠酶及其編碼基因和高效的制備方法，屬于基因工程領(lǐng)域。該方法主要包括以下步驟：將成熟的重組果膠酶基因DNA序列克隆到畢赤酵母的表達載體pPICZαA，并將重組質(zhì)粒經(jīng)電轉(zhuǎn)化法整合到畢赤酵母宿主菌X?33中，即可獲得能高效分泌表達、高效降解果膠，高純度的重組果膠酶，本發(fā)明制備的內(nèi)切果膠酶可廣泛應用于食品、藥品、生物能源等領(lǐng)域。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明提供了一種高效分泌表達重組黑曲霉果膠酶的方法。用該方法制備的上清中重組果膠酶達0.62mg/ml，發(fā)酵酶活力高達200U/ml，能高效降果膠產(chǎn)生高純度的果膠寡糖，SDS-PAGE檢測分泌酶的純度達到90％。本發(fā)明制備的重組果膠酶具有潛在的工業(yè)應用價值，可廣泛應用于食品、藥品、生物質(zhì)轉(zhuǎn)化等領(lǐng)域。

背景技術(shù)

果膠分子是由不同酯化度的半乳糖醛酸以α-1,4糖苷鍵聚合而成的多糖鏈, 常帶有鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖、海藻糖、芹菜糖等組成的側(cè)鏈,游離的羧基部分或全部與鈣、鉀、鈉離子,特別是與硼化合物結(jié)合在一起.它存在于所有的高等植物中,沉積于初生細胞壁和細胞間層,在初生壁中與不同含量的纖維素、半纖維素、木質(zhì)素的微纖絲以及某些伸展蛋白(extensin)相互交聯(lián),使各種細胞組織結(jié)構(gòu)堅硬,表現(xiàn)出固有的形態(tài).果膠分子的結(jié)構(gòu)因植物的種類、組織部位、生長條件等的不同而不同,其大致的結(jié)構(gòu)可分為光滑區(qū)(smooth region)和須狀區(qū)(hairy region)兩部分,主要由HGA、RG-Ⅰ和RG-Ⅱ三個結(jié)構(gòu)區(qū)域構(gòu)成,其中RG-Ⅱ常以二聚體的形式存在.同其它植物多糖一樣,果膠也是多分子的、多分散的、多結(jié)構(gòu)的、有高級空間構(gòu)象的,也具有一定的相對分子質(zhì)量分布.

果膠由于其不溶性，不能被人類很好利用，它必須通過果膠酶(pectolyticenzyme or pectinase)降解成水溶性寡糖。果膠酶是指能夠分解果膠物質(zhì)的多種酶的總稱.許多霉菌及少量的細菌和酵母菌都可產(chǎn)生果膠酶,主要以曲霉和桿菌為主. 新近報道的其它菌有青霉如意大利青霉(Penicillium itaticum)、擴展青霉 (Penicilliumexpansum)以及Penicilliumgriseoroseum等,白絹菌(Sclerotium rolfsii)、立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)、微小毛霉(Mucorpusilus)、高大毛霉(Mucor mucedo)、熱解糖梭菌(Cloctridium thermosaccharolyticum)、匐枝根霉(Rhizopus stolonifer)、出芽短梗霉(Aureobasidu-im pullulans)、粗糙鏈孢霉(Neurospora rassa) 嗜熱側(cè)孢霉(Sporotrichum thermophile)]等.由于真菌中的黑曲霉(Aspergillus niger) 屬于公認安全級(GRAS,General Regarded As Safe),其代謝產(chǎn)物是安全的,因此目前市售的食品級果膠酶主要來源于黑曲霉,最適pH值一般在酸性范圍.

果膠酶大致分為果膠水解酶(pectin hydrolas-es)、果膠裂解酶(pentinlyases, PL)、果膠酯酶(pectin esterases,PE)和原果膠酶等,其中果膠水解酶又可分為聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonas-es,PG)、聚半乳糖醛酸甲酯水解酶 (polymethylga-lacturonases,PMG)、聚鼠李半乳糖醛酸酶(rham-nogalacturonases, RHG)、阿拉伯聚糖酶、半乳聚糖酶、木糖基半乳糖醛酸酶(xylogalacturonase)等, 由于人們對PG的認識最早、應用最廣泛,因此早先常被稱為果膠酶(pectinase).為避免發(fā)生概念混淆,國際上常用Pectolytic Enzyme來代替Pectinase.PMG水解高酯化果膠分子的α-1,4糖苷鍵,而PG則通過水解作用切斷果膠酸分子的α-1,4糖苷鍵,后者對果膠的水解速度及程度隨果膠酸酯化程度的增加而降低,與PE協(xié)同作用可加速降解。