[發明專利]一種來自多能干細胞的中胚層譜系間充質干細胞及其制備方法

有效

• 申請號: 201711241989.5
• 申請日: 2017-11-30
• 公開（公告）號: CN107937338B
• 公開（公告）日: 2021-08-03
• 發明（設計）人: 項鵬;李偉強;翟志臣;宋武
• 申請（專利權）人: 中山大學
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 段卉

本發明公開了一種來自多能干細胞的中胚層譜系間充質干細胞及其誘導分化方法，其是體外貼壁培養多能干細胞，保持其未分化狀態；將細胞制備成單細胞或細胞團塊懸液，接種于包被基質膠的培養皿上，使用多能干細胞培養液進行培養；細胞貼壁后在培養液中添加GSK?3通路抑制劑組合；生長2～10天后，得到中胚層祖細胞群體；使用間充質干細胞培養液持續傳代培養2～6次后檢測間充質的細胞表型，即得。本發明解決成人來源間充質干細胞及其他非限定誘導途徑多能干細胞來源的間充質干細胞異質性與混雜的缺點，獲得的中胚層譜系間充質干細胞具有更強的增殖與免疫調節能力；標準化誘導分化程序可保證不同批次間獲得的細胞群具有良好的一致性。

技術領域

本發明屬于生物與醫學領域，更具體地，本發明涉及一種來自多能干細胞的中胚層譜系間充質干細胞及其制備方法，包括使用特殊的培養條件和選擇技術。本發明還涉及利用這群中胚層譜系間充質干細胞的治療方法或其臨床應用。

背景技術

間充質干細胞(MSCs)屬于成體干細胞的一種，是在成人體內許多組織如骨髓、臍帶血、脂肪和外周血等中都存在的一大類多能細胞，在正常時處于靜止狀態，當所在的組織或器官受到損傷時，他們可以迅速進入增殖狀態并保持極大的增殖潛力，并分化為不同的細胞類型以修復受損組織。最先發現的一類MSCs是骨髓間充質干細胞(Friedenstein A J,J Embryol Exp Morphol,1966)，其能在不同的誘導條件下向骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、肌肉細胞、神經細胞、造血支持細胞等方向分化，具有典型的干細胞特點。

由于MSCs具有易于分離擴增及具有多向分化潛能等優點，最早被認為是組織工程理想的種子細胞而成為研究熱點。隨后發現MSCs具有強大的免疫調節能力，更進一步推動了MSCs相關的研究，使其成為最有希望實現臨床化的明星細胞之一。但MSCs難以規模化擴增及異質性是目前限制MSCs臨床化應用的兩大障礙(Banfi et al.,2000)。

鑒于MSCs廣泛的來源及異質性，為了規范MSCs相關的實驗與臨床治療研究，國際間充質干細胞治療委員會ISCT于2006年提出鑒定MSCs的三個標準：(1)細胞可以粘附于塑料培養器皿；(2)細胞表達特定的表面抗原，其中CD44，CD73，CD90，STRO-1和CD105/SH2陽性率95％，CD11,CD14,CD34和CD45陽性率2％；(3)細胞的多向分化潛能，即可以分化為軟骨細胞、骨細胞及脂肪細胞等(Dominici et al.,2006)。

但即使培養中的細胞完全符合ISCT所提出的三個標準，MSCs功能上的差異也相當明顯，直接導致MSCs表現出增殖能力、分化能力等各方面的差異(RazzoukSchoor,2012)。在ClinicalTrials上登記的MSC臨床研究中很大比例都因結果不穩定而不得不中止研究宣告失敗，導致這種差異性結果及臨床效果不佳的主要原因是MSCs為異質性細胞群體，不同個體、不同組織來源、甚至同一組織提取到的MSCs都為包含多種亞型的異質性群體，不同亞型的MSCs亞型功能各異。Anokhina通過將MSCs體外擴增50代，比較MSCs的異質性，發現隨著傳代次數的增加，MSCs的異質性有所下降，不同個體MSCs表達相同的表面標志，說明體外擴增可以選擇性地篩選MSCs亞群，但是MSCs的分化功能則產生了較大的差異(AnokhinaBuravkova,2007)。這些研究結果表明長期或大量體外擴增加于MSCs群體上的選擇壓力將極大地影響MSCs種群的構成、分化性能及治療功效，導致不同甚至相反的結果(Phinney,2012)。即使MSCs的表面表型沒有可檢測到的變化，MSCs在持續傳代過程中也會丟失其多能性，或特異性地篩選出性能不佳的亞型(Banfi et al.,2000)。因此，區分不同亞群MSCs，進而篩選出在相關應用中起關鍵作用的MSCs亞群，消除其異質性的影響是目前將MSCs臨床應用的關鍵技術之一。