[發明專利]一種無創傷胃癌唾液生物標記物的篩選方法

在審

• 申請號: 201711237539.9
• 申請日: 2017-11-30
• 公開（公告）號: CN108152508A
• 公開（公告）日: 2018-06-12
• 發明（設計）人: 吳正治;黃飛娟;范大華;姚永超;曹美群;孫珂煥;丁峰
• 申請（專利權）人: 深圳市老年醫學研究所;吳正治
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/574
• 代理公司: 北京華智則銘知識產權代理有限公司 11573
• 代理人: 陳向敏

1.一種無創傷胃癌唾液生物標記物的篩選方法，其特征在于，具體步驟如下：

(1)蛋白樣品的準備：向凍存的唾液蛋白樣品中加入600μL的1X裂解液，以超聲波2秒停3秒，Amp20％的條件在超聲破碎儀上超聲2min，直至樣品全部溶解變澄清；再繼續在冰上裂解30min后，用提前預冷到4℃的離心機以20，000g離心40min；棄沉淀取上清，加入3kDa的超濾管中，用4℃離心機以14000g離心超濾30min，濃縮蛋白；完成后再向超濾管中加入200μL1X裂解液，在4℃狀態下，以14000g超濾20min，重復3次；超濾結束后，收集蛋白溶液，做好命名標記保存于-20℃冰箱；

(2)蛋白定量：蛋白定量使用標準BCA定量試劑盒，取96孔板，制作BSA標準曲線；然后根據樣品數量配制工作液并充分混勻；每孔加入200μLBCA工作液，每個樣品及標準品3個重復孔；完成后將96孔板放入37℃溫箱孵育30min；檢測562nm波長下光吸收值，繪制標準曲線并得到該曲線公式，利用標準曲線公式及吸光度計算蛋白樣品濃度；

(3)蛋白酶解及冷凍干燥：100μg的蛋白樣品用6M的尿素稀釋至500μL，并將稀釋后的樣品放入3k超濾管；使用提前預冷的4℃離心機以14000g離心15min后丟棄濾液，加入500μL的10mmol/LDTT+25mmol/LTEAB混合液，再以同樣速度離心15min后丟棄濾液，重復三次后將3k超濾管中的樣品置于室溫孵育，時間為1h；再加入500μL20mmol/LIAA+25mmol/LTEAB混合液，以14000g于4℃離心機離心15min，棄濾液，重復三次將3k超濾管中樣品置于室溫避光孵育45min；再加入500μL25mmol/LTEAB，以14000g于4℃離心機離心15min；棄濾液重復步驟6兩次后將3k超濾管中的樣品，以1000g于4℃離心1min轉移至新的1.5mlEP管中；加入100mmol/LTEAB調整pH至8.5，并向每個樣品加入2μg的胰蛋白酶，置于37℃溫箱孵育過夜；酶解后的樣品以-5℃進行真空干燥過夜；樣品完全干燥后于4℃離心機以12000g離心10min，去掉封口膜做好命名標記后放置于-80℃保存；

(4)iTRAQ標記樣品：將iTRAQ的6個標記試劑經50ul異丙醇稀釋后以1000g離心1min使iTRAQ試劑離心到試管底部；將標記物與對應樣品混合，并用100mmol/LTEAB將所有樣品的pH值調整至8.5左右；室溫避光放置1h后向各管中加入100ul超純水使標記物失活，混合6組樣品，凍干保存；

(5)C18脫鹽：在C18填充的SPE管中加入200μL50％乙腈，以1200g條件室溫離心1min，重復一次；用5％乙腈和0.1％TFA溶液將樣品重新溶解，并用此溶液潤洗C18填充的SPE管；完成后再以1200g條件室溫離心1min，重復潤洗步驟三次；隨后用70％乙腈30μL洗脫結合在C18填充材料上的多肽，為了提高洗脫效率以1200g的條件室溫離心1min，重復兩次；脫鹽的樣品中的乙腈在真空濃縮儀中去除，并等待上機檢測；

(6)液相分離及質譜鑒定：樣品經脫鹽處理后以SolventA為流動相，設紫外檢測波長為214nm/280nm，流速為2uL/min，10min進樣讓樣品充分富集在脫鹽柱上，線性梯度洗脫后真空離心濃縮；利用5-55％梯度的Solvent B將樣品通過分析柱，90min后停止；質譜鑒定：質譜檢測器使用Triple TOF 5600 System，所得串級質譜數據通過Protein Pilot Software4.5檢索SwissProt數據，并以Mascot為檢索引擎進行搜庫；

(7)數據分析：利用Panther Classificition System對篩選出的差異蛋白進行包括生物學進程、分子功能的以及細胞組分的GO功能富集；接著利用STRING分析軟件對差異蛋白進行蛋白相互作用分析；隨后對差異蛋白進行KEGG信號通路分析；

(8)檢測結果：對胃癌組和正常對照組進行對比實驗，定量蛋白質組學研究結果顯示：鑒定1297個蛋白；與正常對照組相比，胃癌組中鑒定到的1.5倍以上表達差異的顯著差異蛋白共140個，其中上調蛋白64個，下調蛋白76個；差異蛋白列表如下：上調蛋白如下：

1)檢索號為O43617，基因注釋為Trafficking protein particle complex subunit3；

2)檢索號為O43847，基因注釋為Nardilysin；

3)檢索號為O60635，基因注釋為Tetraspanin-1；

4)檢索號為O75531，基因注釋為Barrier-to-autointegration factor；

5)檢索號為O95969，基因注釋為Secretoglobin family 1D member 2；

6)檢索號為P00480，基因注釋為Ornithine carbamoyltransferase,mitochondrial；

7)檢索號為P01040，基因注釋為Cystatin-A；

8)檢索號為P01699，基因注釋為Ig lambda chain V-I region VOR；

9)檢索號為P01764，基因注釋為Ig heavy chain V-III region 23；

10)檢索號為P01773，基因注釋為Ig heavy chain V-III region BUR；

11)檢索號為P02538，基因注釋為Keratin,type II cytoskeletal 6A；

12)檢索號為P02549，基因注釋為Spectrin alpha chain,erythrocytic 1；

13)檢索號為P02795，基因注釋為Metallothionein-2；

14)檢索號為P05109，基因注釋為Protein S100-A8；

15)檢索號為P06702，基因注釋為Protein S100-A9；

16)檢索號為P06703，基因注釋為Protein S100-A6；

17)檢索號為P08246，基因注釋為Neutrophil elastase；

18)檢索號為P12532，基因注釋為Creatine kinase U-type,mitochondrial；

19)檢索號為P13646，基因注釋為Keratin,type I cytoskeletal 13；

20)檢索號為P13987，基因注釋為CD59 glycoprotein OS＝Homo sapiens；

21)檢索號為P19013，基因注釋為Keratin,type II cytoskeletal 4；

22)檢索號為P22528，基因注釋為Cornifin-B OS＝Homo sapiens；

23)檢索號為P27918，基因注釋為Properdin OS＝Homo sapiens；

24)檢索號為P30050，基因注釋為60S ribosomal protein L12；

25)檢索號為P31151，基因注釋為Protein S100-A7；

26)檢索號為P35321，基因注釋為Cornifin-A；

27)檢索號為P47755，基因注釋為F-actin-capping protein subunit alpha-2；

28)檢索號為P49643，基因注釋為DNA primase large subunit；

29)檢索號為P50452，基因注釋為Serpin B8；

30)檢索號為P58062，基因注釋為Serine protease inhibitor Kazal-type 7；

31)檢索號為P59665，基因注釋為Neutrophil defensin 1；

32)檢索號為P80188，基因注釋為Neutrophil gelatinase-associated lipocalin；

33)檢索號為Q00872，基因注釋為Myosin-binding protein C,slow-type；

34)檢索號為Q07654，基因注釋為Trefoil factor 3；

35)檢索號為Q13232，基因注釋為Nucleoside diphosphate kinase 3；

36)檢索號為Q14210，基因注釋為Lymphocyte antigen 6D；

37)檢索號為Q14314，基因注釋為Fibroleukin；

38)檢索號為Q14766，基因注釋為Latent-transforming growth factor beta-binding protein 1；

39)檢索號為Q53FA7，基因注釋為Quinone oxidoreductase PIG3；

40)檢索號為Q5T7N2，基因注釋為LINE-1type transposase domain-containingprotein 1；

41)檢索號為Q6ZWK6，基因注釋為Transmembrane protease serine 11F；

42)檢索號為Q86SG5，基因注釋為Protein S100-A7A；

43)檢索號為Q86UR5，基因注釋為Regulating synaptic membrane exocytosisprotein 1；

44)檢索號為Q8N4H5TOM5，基因注釋為Mitochondrial import receptor subunitTOM5 homolog；

45)檢索號為Q8NFT8，基因注釋為Delta and Notch-like epidermal growth factor-related receptor；

46)檢索號為Q92876，基因注釋為Kallikrein-6；

47)檢索號為Q96RM1，基因注釋為Small proline-rich protein 2F；

48)檢索號為Q99523，基因注釋為Sortilin；

49)檢索號為Q9BXX3，基因注釋為Ankyrin repeat domain-containing protein 30A；

50)檢索號為Q9GZP4，基因注釋為PITH domain-containing protein 1；

51)檢索號為Q9H583，基因注釋為HEAT repeat-containing protein 1；

52)檢索號為Q9HB71，基因注釋為Calcyclin-binding protein；

53)檢索號為Q9NR99，基因注釋為Matrix-remodeling-associated protein 5；

54)檢索號為Q9NX78，基因注釋為Transmembrane protein 260；

55)檢索號為Q9UFN0，基因注釋為Protein NipSnap homolog 3A；

56)檢索號為Q9UHV9，基因注釋為Prefoldin subunit 2；

57)檢索號為Q9ULS5，基因注釋為Transmembrane and coiled-coil domains protein3；

58)檢索號為Q9Y546，基因注釋為Leucine-rich repeat-containing protein 42；

59)檢索號為Q9Y6Q9，基因注釋為Nuclear receptor coactivator 3；

下調蛋白如下：

1)檢索號為O00764，基因注釋為Pyridoxal kinase；

2)檢索號為O14497，基因注釋為AT-rich interactive domain-containing protein1A；

3)檢索號為O15111，基因注釋為Inhibitor of nuclear factor kappa-B kinasesubunit alpha；

4)檢索號為O43852，基因注釋為Calumenin；

5)檢索號為O60610，基因注釋為Protein diaphanous homolog 1；

6)檢索號為O76070，基因注釋為Gamma-synuclein；

7)檢索號為O95817，基因注釋為BAG family molecular chaperone regulator 3；

8)檢索號為P01036，基因注釋為Cystatin-S；

9)檢索號為P02748，基因注釋為Complement component C9；

10)檢索號為P02808，基因注釋為Statherin；

11)檢索號為P04062，基因注釋為Glucosylceramidase；

12)檢索號為P04745，基因注釋為Alpha-amylase 1；

13)檢索號為P06733，基因注釋為Alpha-enolase；

14)檢索號為P07360，基因注釋為Complement component C8 gamma chain；

15)檢索號為P07711，基因注釋為Cathepsin L1；

16)檢索號為P08697，基因注釋為Alpha-2-antiplasmin；

17)檢索號為P0C0S5，基因注釋為Histone H2A.Z；

18)檢索號為P15309，基因注釋為Prostatic acid phosphatase；

19)檢索號為P15515，基因注釋為Histatin-1；

20)檢索號為P16278，基因注釋為Beta-galactosidase；

21)檢索號為P16870，基因注釋為Carboxypeptidase E；

22)檢索號為P23219，基因注釋為Prostaglandin G/H synthase 1；

23)檢索號為P23280，基因注釋為Carbonic anhydrase 6；

24)檢索號為P28325，基因注釋為Cystatin-D；

25)檢索號為P30085，基因注釋為UMP-CMP kinase；

26)檢索號為P30408，基因注釋為Transmembrane 4 L6 family member 1；

27)檢索號為P30740，基因注釋為Leukocyte elastase inhibitor；

28)檢索號為P41218，基因注釋為Myeloid cell nuclear differentiation antigen；

29)檢索號為P42025，基因注釋為Beta-centractin；

30)檢索號為P50747，基因注釋為Biotin--protein ligase；

31)檢索號為P51610，基因注釋為Host cell factor 1；

32)檢索號為P58499，基因注釋為Protein FAM3B；

33)檢索號為P62328，基因注釋為Thymosin beta-4；

34)檢索號為P63313，基因注釋為Thymosin beta-10；

35)檢索號為P68032，基因注釋為Actin,alpha cardiac muscle 1；

36)檢索號為P68431，基因注釋為Histone H3.1；

37)檢索號為P80303，基因注釋為Nucleobindin-2；

38)檢索號為Q01813，基因注釋為ATP-dependent 6-phosphofructokinase,platelettype；

39)檢索號為Q04118，基因注釋為Basic salivary proline-rich protein 3；

40)檢索號為Q05315，基因注釋為Galectin-10；

41)檢索號為Q09MP3，基因注釋為RAD51-associated protein 2；

42)檢索號為Q15008，基因注釋為26S proteasome non-ATPase regulatory subunit6；

43)檢索號為Q15370，基因注釋為Transcription elongation factor B polypeptide2；

44)檢索號為Q15782，基因注釋為Chitinase-3-like protein 2；

45)檢索號為Q15942，基因注釋為Zyxin；

46)檢索號為Q2QGD7，基因注釋為Zinc finger protein ZXDC；

47)檢索號為Q3ZCW2，基因注釋為Galectin-related protein；

48)檢索號為Q53EP0，基因注釋為Fibronectin type III domain-containingprotein 3B；

49)檢索號為Q5SNV9，基因注釋為Uncharacterized protein C 1orf167；

50)檢索號為Q6PIF6，基因注釋為Unconventional myosin-VIIb；

51)檢索號為Q6ZSZ6，基因注釋為Teashirt homolog 1；

52)檢索號為Q8IUE6，基因注釋為Histone H2A type 2-B；

53)檢索號為Q8IWQ3，基因注釋為Serine/threonine-protein kinase BRSK2；

54)檢索號為Q8IZF0，基因注釋為Sodium leak channel non-selective protein；

55)檢索號為Q8N4F0，基因注釋為BPI fold-containing family B member 2；

56)檢索號為Q8NBJ4，基因注釋為Golgi membrane protein 1；

57)檢索號為Q8NBS9，基因注釋為Thioredoxin domain-containing protein 5；

58)檢索號為Q8TAX7，基因注釋為Mucin-7；

59)檢索號為Q8TBY0，基因注釋為Probable RNA-binding protein 46；

60)檢索號為Q8WWL2，基因注釋為Protein spire homolog 2；

61)檢索號為Q8WWY7，基因注釋為WAP four-disulfide core domain protein 12；

62)檢索號為Q92485，基因注釋為Acid sphingomyelinase-like phosphodiesterase3b；

63)檢索號為Q92521，基因注釋為GPI mannosyltransferase 3；

64)檢索號為Q92747，基因注釋為Actin-related protein 2/3complex subunit 1A；

65)檢索號為Q96CN5，基因注釋為Leucine-rich repeat-containing protein 45；

66)檢索號為Q96DA0，基因注釋為Zymogen granule protein 16 homolog B；

67)檢索號為Q96DR5，基因注釋為BPI fold-containing family A member 2；

68)檢索號為Q96G27，基因注釋為WW domain-binding protein 1；

69)檢索號為Q96P20，基因注釋為NACHT,LRR and PYD domains-containing protein3；

70)檢索號為Q96Q06，基因注釋為Perilipin-4；

71)檢索號為Q99592，基因注釋為Zinc finger and BTB domain-containing protein18；

72)檢索號為Q99832，基因注釋為T-complex protein 1 subunit eta OS＝Homosapiens；

73)檢索號為Q9BYX7，基因注釋為Putative beta-actin-like protein 3；

74)檢索號為Q9BZ71，基因注釋為Membrane-associated phosphatidylinositoltransfer protein 3；

75)檢索號為Q9HBR0，基因注釋為Putative sodium-coupled neutral amino acidtransporter 10；

76)檢索號為Q9HC38，基因注釋為Glyoxalase domain-containing protein 4；

77)檢索號為Q9NR45，基因注釋為Sialic acid synthase；

78)檢索號為Q9NW08，基因注釋為DNA-directed RNA polymerase III subunit RPC2；

79)檢索號為Q9UGN4，基因注釋為CMRF35-like molecule 8；

80)檢索號為Q9Y287，基因注釋為Integral membrane protein 2B；

81)檢索號為Q9Y2J8，基因注釋為Protein-arginine deiminase type-2；

82)檢索號為Q9Y2K3，基因注釋為Myosin-15 OS＝Homo sapiens；

83)檢索號為Q9Y496，基因注釋為Kinesin-like protein KIF3A；

84)檢索號為Q9Y4U1，基因注釋為Methylmalonic aciduria and homocystinuriatype C protein；

85)檢索號為Q9Y646，基因注釋為Carboxypeptidase Q。