[發明專利]基于熒光定量PCR檢測銀鯧的引物和探針及其試劑盒與方法

有效

• 申請號: 201711230573.3
• 申請日: 2017-11-29
• 公開（公告）號: CN108085396B
• 公開（公告）日: 2021-03-02
• 發明（設計）人: 葉蕾;曹煒偉;陳洵;白衛濱;徐明芳;常彥磊;石磊
• 申請（專利權）人: 暨南大學
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 廣州市智遠創達專利代理有限公司 44619
• 代理人: 王會龍

本發明公開了一種基于定量PCR技術快速鑒別銀鯧的檢測引物和探針，以及采用了該引物和探針的檢測試劑盒和檢測方法。檢測引物組包括上游引物FP、下游引物BP和探針；檢測試劑盒包括引物液、PCR MIX反應液、去離子水、陰性對照和陽性對照。其檢測方法是通過提取待檢樣品DNA，利用熒光定量PCR技術對待檢樣品DNA進行快速檢測，通過實時擴增曲線判斷待檢樣品是否為銀鯧。本發明具有快速、靈敏、特異、易操作等優點，適于推廣應用等優點。

技術領域

本發明屬于分子生物學技術領域，涉及一種基于熒光定量PCR檢測銀鯧的引物和探針及其試劑盒與方法。

背景技術

銀鯧（Pampus argenteu），屬于硬骨魚綱，輻鰭亞綱，鱸形目，是我國主要的海產經濟魚類之一，廣泛分布于我國沿海地區，北起渤海南至南海均有銀鯧分布。由于銀鯧具有較高的經濟食用價值，不少商家為了謀求高額利潤，在海產品捕撈、加工處理、市場流通等環節，存在以次充好（如用便宜的金鯧代替銀鯧）、亂貼標簽的現象。目前關于鑒定銀鯧的報道較少，主要依賴于傳統的形態學鑒別法，但需要從業人員具備較強的專業背景知識，受主觀判斷影響大，易出錯。而以分子生物學為基礎的檢測方法主要包括微衛星分子標記、隨機引物擴增多態性、限制性長度多態性等，但這些方法存在耗時長、操作復雜、重復性差和誤差大等弊端。為了對魚肉及其制品進行溯源，亟需快速、精準、高效的鑒定方法。

發明內容

有鑒于此，本發明所解決的技術問題在于提供一種基于熒光定量PCR檢測銀鯧的引物和探針。

本發明所解決的技術問題還在于提供一種基于熒光定量PCR檢測銀鯧的試劑盒。

本發明所解決的技術問題還在于提供一種基于熒光定量PCR檢測銀鯧的方法。

為了解決上述技術問題，本發明所采用的技術方案如下：

一方面，本發明提供了一種基于熒光定量PCR檢測銀鯧的引物和探針，包括上游引物FP、下游引物BP、探針Probe，其核苷酸序列分別如下所示：

FP：5’-GCCTATTTACCCAGTTTTC-3’；

BP：5’-GGTCAGGATCTCATTGTA-3’；

Probe：5’-FAM-TCATTCCGAGCAGCCTAGTAGC-TAMRA-3’，其中5’端標記的熒光基團是FAM，3’端標記的淬滅基團是TAMRA。

優選地，擴增反應時，FP引物、BP引物和探針的摩爾比為：2：2：1。

另一方面，本發明還公開了一種基于熒光定量PCR檢測銀鯧的試劑盒，該試劑盒包含權利要求1或2中所述的檢測引物和探針。

優選地，該基于熒光定量PCR檢測銀鯧的試劑盒還包括以下成分的部分或者全部：（1）PCR MIX反應液；（2）去離子水；（3）陽性對照和陰性對照。

優選地，所述的PCR MIX反應液含有：5U Taq酶，2.5mM dNTPs，25mM MgCl2，2×PCRbuffer。

再有，本發明還公開了一種基于熒光定量PCR檢測銀鯧的方法，包括如下步驟：

（1）待檢樣品DNA的提取；

（2）熒光定量PCR反應體系的配制：將步驟（1）中提取的待檢樣品DNA加入熒光定量PCR反應體系，混勻后離心，所述熒光定量PCR反應體系中含有如權利要求1或2中所述的引物和探針；

（3）熒光定量PCR反應：設置陽性對照和陰性對照，將配好的熒光定量PCR反應體系置于熒光定量PCR儀后開始反應，反應程序如下：95℃反應10min；95℃反應15sec，60℃反應60sec，45個循環，每循環延伸結束時收集熒光信號；