[發明專利]一種快速分離煙草內生真菌的方法

有效

• 申請號: 201711202159.1
• 申請日: 2017-11-27
• 公開（公告）號: CN109837216B
• 公開（公告）日: 2021-04-27
• 發明（設計）人: 張鵬;李盼盼;申國明;高林;李青誠;高加明;李方明;余軍
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院煙草研究所
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;C12N1/02
• 代理公司: 北京慕達星云知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11465
• 代理人: 崔自京

本發明提出了一種快速分離煙草內生真菌的方法，包括對煙株組織表面的三步消毒、切片培養、內生真菌菌株的分離純化和保存等步驟。本發明采用組織分離法，從煙草植株的根、莖、葉中進行內生真菌的分離培養，可以更好地發掘煙草內生真菌的生物多樣性；同時，針對煙草材料的組織特點，選擇了合適的表面消毒時間和消毒劑，建立了“75％乙醇(1min)?2.5％次氯酸鈉(30s)?75％乙醇(1min)”三步消毒法，可以在最大程度上保證內生真菌分離效果。本發明的特點和意義在于建立了更為完善的煙草內生真菌的分離技術方法，實現對其更加快速及準確的分離；本發明對于煙草內生真菌資源的充分利用、煙草農業生產的健康可持續發展具有重要意義。

技術領域

本發明涉及一種快速分離煙草內生真菌的方法，屬于微生物學領域。

背景技術

植物內生真菌是指在其生活史的一定階段或全部階段生活在健康植物各種組織和器官內部或者組織間隙中的一類真菌。其與宿主植物建立了和諧的互利共生關系，是植物體微生態系統的重要組成部分。內生真菌在植物生長發育及在植物生物和非生物脅迫中發揮著重要作用，研究表明內生真菌能促進植物生長、誘導植物產生抗病性、提高植物對重金屬的耐性、減輕重金屬對植物的不良影響等。植物內生真菌分布廣泛、活性多樣，已在多種植物中得到研究。此外，近年來的研究表明，生活在植物體這一特殊生態環境中的內生真菌能夠與宿主發生協同進化，產生與宿主相同或相似的活性次級代謝產物，包括抑菌、抗腫瘤、促生長因子、抗氧化活性物質等，在醫藥、農業領域有很大的應用潛力。

煙草內生真菌是與煙草(Nicotinana tabacum)有互利共生關系的生態類群，煙草內生真菌廣泛分布于煙草根、莖、葉中，具有豐富的生物多樣性，是煙田微生物群落的重要成員。煙草內生真菌不僅能促進煙草生長，增強抗病蟲能力，提高煙草品質和抗逆性(抗病蟲害、抗重金屬和抗干旱脅迫)，還具有降低煙草亞硝胺含量，改善煙葉品質的積極作用。因此，煙草內生真菌的研究及開發對闡明煙草內生真菌的種類、分布特點，提高煙葉品質具有重要意義。

目前對煙草內生真菌研究較少，僅有一個專利涉及煙草內生真菌的分離和鑒定(一種快速分離、鑒定煙草內生真菌的方法，公開號：CN105018351A)。其涉及的分離技術手段包括：煙葉表面消毒、切片培養、菌絲的分離純化和保存。其所闡述的煙草內生真菌的分離方法只適用于從煙草葉片中分離培養煙草內生真菌，不能很好地揭示煙草內生真菌在不同部位(根、莖、葉)的分布規律及種群結構；其表面消毒采用75％的乙醇浸泡2～3min，此消毒方法幾乎適用于所有植物，而無法對煙草組織易霉變、稚嫩的特點進行針對性地分離。同時，上述消毒過程中消毒液有可能滲透到組織內，從而殺死組織里的一些內生真菌；或者消毒不徹底，導致表面附生真菌被分離，不能反映煙草內生真菌的真實群落結構。

發明內容

基于上述問題，本發明目的在于提供一種采用組織分離法，選擇合適的表面消毒時間和消毒劑，建立了“75％乙醇(1min)-2.5％次氯酸鈉(30s)-75％乙醇(1min)”三步消毒法，在最大程度上保證內生真菌分離效果的快速分離煙草內生真菌的方法。

針對以上問題，提供了如下技術方案：一種快速分離煙草內生真菌的方法，其特征在于：包括對煙株組織表面的三步消毒、切片培養、內生真菌菌株的分離純化和保存，具體步驟如下：

(1)用無菌水充分沖洗健康煙株的根、莖、葉；

(2)將步驟(1)中處理后的煙草組織先在75％乙醇中浸泡1～2min，然后放入2.5％次氯酸鈉中浸泡25～35s后，再放入75％乙醇中浸泡1～2min，最后用無菌水沖洗多次，完成表面消毒；

(3)檢驗步驟(2)中的消毒是否徹底：取最后一次沖洗的無菌水，用涂布法涂布于培養基上，看是否有雜菌長出，若沒有雜菌長出則消毒徹底；若有雜菌長出則消毒不徹底，需重復消毒；

(4)將步驟(2)中的煙草組織去除邊緣，切成0.5×0.5cm小塊插入PDA培養基中培養；