[發明專利]利用雙熒光素酶報告基因檢測鴨IFN-β啟動子活性的方法有效
| 申請號： | 201711195597.X | 申請日： | 2017-11-24 |
| 公開（公告）號： | CN108004270B | 公開（公告）日： | 2021-06-18 |
| 發明（設計）人： | 孫建和;劉云霞;程玉強;嚴亞賢 | 申請（專利權）人： | 上海交通大學 |
| 主分類號： | C12N15/85 | 分類號： | C12N15/85;C12N15/66;C12Q1/66 |
| 代理公司： | 上海漢聲知識產權代理有限公司 31236 | 代理人： | 莊文莉 |
| 地址： | 200240 *** | 國省代碼： | 上海;31 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 利用 熒光 報告 基因 檢測 ifn 啟動子 活性 方法 | ||
1.一種利用雙熒光素酶報告基因檢測鴨IFN-β啟動子活性的方法，其特征在于，包括以下步驟：
A、構建含鴨IFN-β啟動子靶序列的螢火蟲熒光素酶重組質粒；
B、將含鴨IFN-β啟動子靶序列的螢火蟲熒光素酶重組質粒與刺激物、內參質粒及脂質體預混后轉染鴨胚成纖維細胞DEF，所述內參質粒為海參熒光素酶質粒；
C、將轉染后的DEF細胞進行培養后裂解，檢測熒光素酶活性，即得鴨IFN-β啟動子活性；
步驟A的構建方法包括以下步驟：將鴨IFN-β啟動子靶序列連接至螢火蟲熒光素酶報告質粒上；
所述鴨IFN-β啟動子靶序列為鴨IFN-β啟動子區域-324位至第一外顯子+63位形成的片段序列；
所述鴨IFN-β基因啟動子序列的GenBank登錄號為KM032183.1；
獲得所述鴨IFN-β啟動子靶序列采用的上游引物的序列如SEQ ID No.2所示；下游引物的序列如SEQ ID No.3所示。
2.根據權利要求1所述的利用雙熒光素酶報告基因檢測鴨IFN-β啟動子活性的方法，其特征在于，獲得所述鴨IFN-β啟動子靶序列采用的PCR擴增的反應條件為：變性 98℃ 10s、退火 58℃ 15s、延伸 68℃ 1min，30個循環，終延伸 68℃ 5min。
3.根據權利要求1所述的利用雙熒光素酶報告基因檢測鴨IFN-β啟動子活性的方法，其特征在于，步驟B中，所述刺激物包括RIG-I、poly(I:C) 或dsDNA中的至少一種。
4.根據權利要求1所述的利用雙熒光素酶報告基因檢測鴨IFN-β啟動子活性的方法，其特征在于，步驟B中，所述轉染細胞采用的脂質體的轉染量為1μL/孔。
5.根據權利要求1所述的利用雙熒光素酶報告基因檢測鴨IFN-β啟動子活性的方法，其特征在于，步驟C中，所述培養時間為20小時。
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