[發明專利]一種全細胞催化劑制備芳香醛和/或芳香醇的方法

有效

• 申請號: 201711156661.3
• 申請日: 2017-11-20
• 公開（公告）號: CN107881188B
• 公開（公告）日: 2021-04-09
• 發明（設計）人: 許平;倪俊;陶飛;高琰琰;唐鴻志
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12P13/00;C12P7/24;C12P7/22
• 代理公司: 上海旭誠知識產權代理有限公司 31220
• 代理人: 鄭立

本發明涉及一種全細胞催化劑制備芳香醛和/或芳香醇的方法，包括以下步驟：步驟一、基因工程菌的構建；步驟二、利用步驟一構建的基因工程菌制備全細胞催化劑；步驟三、通過溫度控制步驟二獲得的全細胞催化劑與肉桂酸衍生物反應生成芳香醛和/或芳香醇。進一步地，當反應溫度＜40℃時，生成的芳香醇的量多于生成的芳香醛的量；當反應溫度＞45℃時，生成的芳香醛的量多于生成的芳香醇的量，從而避免了對中溫宿主中多個醇脫氫酶的敲除，為芳香生物基聚合物的生產開辟了新的技術，具有重要的現實意義和工業應用價值。本發明還涉及一種全細胞催化劑及其構建方法。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種全細胞催化劑制備芳香醛和/或芳香醇的方法，以及該全細胞催化劑的構建方法。

背景技術

近年來，由于石化資源的限制和環境問題的日益凸顯，生物基的聚合物得到越來越多的關注。通常，聚合物骨架中的芳香族單元(芳香醛/醇單體)可以提高聚合物的硬度、疏水性和防火性。芳香醇是碳鏈上連接有苯環的醇，芳香醛類物質則是指含有羰基的芳香族化合物，這類物質可以廣泛用作聚合物單體、香料和激素等。比如有“香料皇后”美譽的香蘭素，在食品、飲料、香精香料及醫藥領域中占據極為重要的地位，其年需求量已經超過了16,000噸。目前，作為芳香族單體，香蘭素也越來越多的用于熱固樹脂和熱固塑料的合成。然而，包括香蘭素在內的芳香醛和芳香醇在植物中的含量非常低，分離和提取較為復雜，使得它們的產量極低，不能滿足日益增長的需求量。化學法是合成芳香醛和芳香醇的主要途徑，但這種方法依賴于石油化工產品和能源，并會對生態環境造成一定危害。

合成生物學和代謝工程的發展使得微生物發酵生產芳香醛和芳香醇成為現實，溫和的反應條件、快速高效生產過程和清潔無污染等優勢使得其成為最具潛力的芳香醛/醇制備方法。以香蘭素為例，包括鏈霉菌、芽孢桿菌、沙雷氏菌、假單胞菌和腸桿菌在內的多種微生物可以轉化不同底物生成香蘭素，這些底物有阿魏酸、丁香酚、木質素、異丁香酚和香蘭酸等。其中，肉桂酸衍生物阿魏酸是生物法制備香蘭素最具潛力的底物，天然存在于一些可再生資源中，如谷糠、玉米麩、麥麩、甜菜等農副產物細胞壁，通過堿法或者酶法可以從這些資源中提取阿魏酸。然而，包括香蘭素在內的芳香醛通常會被微生物中內源的多種廣底物譜醇脫氫酶快速還原為相應的芳香醇。2000年，Li等人嘗試利用諾卡氏菌的全細胞催化劑對苯甲基香草酸轉化為對苯甲基香蘭素，然而由于內源醇脫氫酶的作用，大多數產物被還原為對苯甲基香草醇。2009年，Hansen等人在酵母菌中構建了香蘭素的從頭合成途徑，但在酵母內源醇脫氫酶的作用下，使得產物中副產物香草醇的量約為香蘭素的2.5倍。因此，微生物內源的醇脫氫酶成為了微生物法制備芳香醛的瓶頸。

目前，有一些研究工作嘗試對微生物內源的醇脫氫酶進行敲除，從而使得包括芳香醛在內的醛類物質得以積累。比如，2012年，Rodriguez等人對大腸桿菌中8個醇脫氫酶進行了敲除，使得異丁醛的產量從0.14g/L/OD₆₀₀提高到1.5g/L/OD₆₀₀,而異丁醇的產量從1.5降低到0.4g/L/OD₆₀₀。2014年，Kunjapur等人在大腸桿菌中敲除了六個醇脫氫酶，從而提高了香蘭素和苯甲醛等芳香醛的產量。然而，對宿主微生物中多個內源酶的敲除是一個非常繁重的工作，會耗費大量的人力和資源。同時，宿主微生物中存在許多鑒定和未被鑒定的醇脫氫酶，準確定位到對目標產物起主要催化作用的酶并對它們進行敲除也是一個巨大的挑戰。因此，需要開發一種新的方法來消除宿主的內源醇脫氫酶活性，避免繁瑣的基因敲除步驟，從而使得芳香醛得以積累。過高的溫度可以使得蛋白變性，從而使得相應的酶活喪失，這為宿主細胞內源醇脫氫酶活性的調節提供了一種新的思路。然而，目前并未有利用溫度來控制包括香蘭素等芳香醛/醇制備的相關報道。

發明內容

針對現有技術的不足，本發明提供了一種全細胞催化劑制備芳香醛和/或芳香醇的方法。該方法避免了對宿主內源醇脫氫酶的敲除，可以直接利用溫度來控制多種芳香醛和/或芳香醇的合成，極大的簡化了生產過程，具有重要的現實意義和工業應用價值。

本發明的技術方案如下：