[發(fā)明專利]一種熒光免疫定量檢測(cè)MFAP納米藥物載體的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201711150950.2
• 申請(qǐng)日: 2017-11-18
• 公開（公告）號(hào): CN107727844A
• 公開（公告）日: 2018-02-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張明翠;閆希
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 安徽師范大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N33/533
• 分類號(hào): G01N33/533
• 代理公司: 蕪湖安匯知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司34107
• 代理人: 任晨晨

1.一種熒光免疫定量檢測(cè)MFAP納米藥物載體的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

a、MFAP全抗原的制備；

b、抗MFAP高特異性多克隆抗體的制備；

c、二氧化硅熒光納米標(biāo)記探針的制備；

d、二氧化硅熒光納米標(biāo)記探針采用過碘酸鈉法偶聯(lián)抗體；

e、熒光免疫定量檢測(cè)MFAP納米藥物載體的方法建立；以MFAP標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，構(gòu)建濃度與熒光強(qiáng)度線性關(guān)系，從而定量檢測(cè)出MFAP的濃度；

步驟c包括以下步驟：

c-1、將十六烷基三甲基溴化銨CTAB溶于去離子水；

c-2、加入乙二醇和濃氨水，反應(yīng)；

c-3、之后加入正硅酸乙酯TEOS反應(yīng)；

c-4、然后，再加入混合好的BODIPY溶液和羅丹明B溶液，再加入三甲氧基甲基硅烷MTMS，反應(yīng)；

c-5、最后，加入3-氨丙基三乙氧基硅烷APTES繼續(xù)反應(yīng)，完成反應(yīng)后，攪拌冷卻至室溫并離心洗滌，冷凍干燥，得二氧化硅熒光納米標(biāo)記探針。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，從步驟c-1開始，全程均在60-70℃條件下反應(yīng)。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，步驟c-3中加入乙二醇和濃氨水后的3-6min內(nèi)加入正硅酸乙酯。

4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，步驟c-4)所述反應(yīng)時(shí)間為2-4h；步驟c-5所述反應(yīng)時(shí)間為1-2h。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟d包括以下步驟:

d-1、抗體的氧化：取步驟b制備的抗MFAP高特異性多克隆抗體溶解到醋酸緩沖液中，再加入過碘酸鈉溶液，于4℃避光攪拌，超濾除去未反應(yīng)的過碘酸鈉，得到氧化抗體；

d-2、熒光納米粒子與抗體的偶聯(lián)：將步驟c制備的二氧化硅熒光納米標(biāo)記探針分散到緩沖溶液中，在攪拌下加入步驟d-1制備的氧化抗體，于4℃下避光攪拌，之后加入硼氫化鈉溶液繼續(xù)4℃避光攪拌，將反應(yīng)后的溶液離心，洗滌分散到緩沖溶液中，4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，步驟d-1中，所述攪拌時(shí)間為2-4h。

7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的方法，其特征在于，步驟d-2中第一步攪拌時(shí)間為12-36h，第二步攪拌時(shí)間為2-4h。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟e包括以下步驟：

e-1、包被：用碳酸鹽緩沖液稀釋將包被抗原溶液稀釋，包被96孔酶標(biāo)板，4℃溫育過夜后，用PBST洗滌液洗滌，甩干；

e-2、封閉：每孔加入封閉液，恒溫培養(yǎng)箱溫育后，用PBST洗滌液洗滌，甩干；

e-3、加樣競(jìng)爭(zhēng)：每孔加入不同濃度的MFAP標(biāo)準(zhǔn)液和與二氧化硅熒光納米標(biāo)記探針偶聯(lián)的抗體，溫育后，用PBST洗滌，甩干；

e-4、在酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔在激發(fā)波長(zhǎng)為485nm，發(fā)射波長(zhǎng)為590nm時(shí)的熒光強(qiáng)度，以MFAP標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，構(gòu)建濃度與熒光強(qiáng)度線性關(guān)系，從而定量檢測(cè)出MFAP的濃度。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，步驟e-2所述溫育是指37℃恒溫培養(yǎng)箱溫育0.5-2h；步驟e-3所述溫育是指37℃溫育1.5-3.5h。

10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，步驟e-4中所述線性關(guān)系為：標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程為A＝34877.2-13538.7lgC，A為熒光強(qiáng)度，C為MFAP的濃度；相關(guān)系數(shù)R＝-0.997，線性范圍為0.036-10⁴ng/mL，檢出限為1.4pg/mL。