[發(fā)明專利]提高牛體細(xì)胞克隆胚和體外受精胚的發(fā)育質(zhì)量的培養(yǎng)液和培養(yǎng)方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201711117369.0
• 申請日: 2017-11-13
• 公開（公告）號: CN107916249A
• 公開（公告）日: 2018-04-17
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張景程;張涌
• 申請（專利權(quán)）人: 西北農(nóng)林科技大學(xué)
• 主分類號: C12N5/073
• 分類號: C12N5/073
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責(zé)任公司61200
• 代理人: 范巍

1.一種提高牛體細(xì)胞克隆胚和體外受精胚的發(fā)育質(zhì)量的培養(yǎng)液，其特征在于：該培養(yǎng)液包括mSOFaa液，所述mSOFaa液包括SOF基礎(chǔ)培養(yǎng)基以及添加物，SOF基礎(chǔ)培養(yǎng)基包括體積分?jǐn)?shù)為0.28～0.285％的乳酸鈉及30～35mg/L的丙酮酸鈉，添加物包括4～8mg/mL的BSA。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種提高牛體細(xì)胞克隆胚和體外受精胚的發(fā)育質(zhì)量的培養(yǎng)液，其特征在于：每100mL SOF基礎(chǔ)培養(yǎng)基包括0.6294g的NaCl、0.0534g的KCl、0.162g的KH₂PO₄、0.0172g的CaCl₂·2H₂O、0.00996g的MgCl₂·6H₂O、0.2106g的NaHCO₃、0.003～0.0035g的丙酮酸鈉以及28～28.5μL的乳酸鈉；所述添加物包括BME、MEM、谷氨酰胺、BSA、慶大霉素及頭孢霉素，其中，BME的體積分?jǐn)?shù)為2％，MEM的體積分?jǐn)?shù)為1％，谷氨酰胺的濃度為1mmol/L，BSA的濃度為4～8mg/mL，慶大霉素的濃度為50μg/mL，頭孢霉素的濃度為50μg/mL。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述一種提高牛體細(xì)胞克隆胚和體外受精胚的發(fā)育質(zhì)量的培養(yǎng)液，其特征在于：所述添加物還包括體積分?jǐn)?shù)為1～10％的血清替代物。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述一種提高牛體細(xì)胞克隆胚和體外受精胚的發(fā)育質(zhì)量的培養(yǎng)液，其特征在于：所述血清替代物選自KSR。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述一種提高牛體細(xì)胞克隆胚和體外受精胚的發(fā)育質(zhì)量的培養(yǎng)液，其特征在于：所述血清替代物于胚胎培養(yǎng)至2-細(xì)胞時期之后再加入培養(yǎng)體系中。

6.一種提高牛體細(xì)胞克隆胚和體外受精胚的發(fā)育質(zhì)量的培養(yǎng)方法，其特征在于：該培養(yǎng)方法包括以下步驟：

將牛克隆重組胚、牛體外受精胚或者處于一定胚胎發(fā)育時期的自體外獲得的牛胚胎置于mSOFaa液中進(jìn)行培養(yǎng)；牛克隆重組胚、牛體外受精胚培養(yǎng)至第78～100h，或者，所述牛胚胎已經(jīng)發(fā)育至2-細(xì)胞時期之后向mSOFaa液中加入血清替代物，然后繼續(xù)培養(yǎng)，mSOFaa液中添加的血清替代物的體積分?jǐn)?shù)為1～10％。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于：所述mSOFaa液包括SOF基礎(chǔ)培養(yǎng)基以及添加物，SOF基礎(chǔ)培養(yǎng)基包括體積分?jǐn)?shù)為0.28～0.285％的乳酸鈉及30～35mg/L的丙酮酸鈉，添加物包括4～8mg/mL的BSA。

8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于：每100mL SOF基礎(chǔ)培養(yǎng)基包括0.6294g的NaCl、0.0534g的KCl、0.162g的KH₂PO₄、0.0172g的CaCl₂·2H₂O、0.00996g的MgCl₂·6H₂O、0.2106g的NaHCO₃、0.003～0.0035g的丙酮酸鈉以及28～28.5μL的乳酸鈉；所述添加物包括BME、MEM、谷氨酰胺、BSA、慶大霉素及頭孢霉素，其中，BME的體積分?jǐn)?shù)為2％，MEM的體積分?jǐn)?shù)為1％，谷氨酰胺的濃度為1mmol/L，BSA的濃度為4～8mg/mL，慶大霉素的濃度為50μg/mL，頭孢霉素的濃度為50μg/mL。

9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于：所述血清替代物選自KSR。

10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于：所述培養(yǎng)方法具體包括以下步驟：將500μL mSOFaa液加入至培養(yǎng)容器中，然后將30～40個牛克隆重組胚或牛體外受精胚置入該培養(yǎng)容器中，然后在38.5℃、5％CO₂、7％O₂以及飽和濕度條件下進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)至第96h時向所述培養(yǎng)容器中加入KSR，mSOFaa液中添加的KSR的體積分?jǐn)?shù)為5％，然后繼續(xù)培養(yǎng)至第8天。