[發明專利]一種促進骨髓間充質干細胞向神經元分化的誘導培養基和誘導方法

在審

• 申請號: 201711115769.8
• 申請日: 2017-11-13
• 公開（公告）號: CN107653227A
• 公開（公告）日: 2018-02-02
• 發明（設計）人: 胡小東;王健;趙翔;熊華強;宋彩霞;王仁杰;邱陽;黃啟程;李國焱;唐玲;葉勁濤;曹玉昊
• 申請（專利權）人: 重慶斯德姆生物技術有限公司
• 主分類號: C12N5/0793
• 分類號: C12N5/0793
• 代理公司: 重慶百潤洪知識產權代理有限公司50219
• 代理人: 高姜

技術領域

本發明屬于細胞培養技術領域，具體涉及一種促進骨髓間充質干細胞向神經元分化的誘導培養基和誘導方法。

背景技術

中樞神經系統(Central Nervous System，CNS)主要有兩大類細胞，神經元和神經膠質細胞，神經膠質細胞又分為大神經膠質細胞(星形膠質細胞、少突膠質細胞)和小神經膠質細胞。神經元和大神經膠質細胞來源于外胚層，而大約占神經膠質細胞的5-20％的小神經膠質細胞被認為來源于骨髓。人們一直以來都認為哺乳動物的CNS是屬于不能再生類的組織，但是，這一神經學的經典法則正受到挑戰，近年的研究已經顯示神經祖細胞具有在CNS進行細胞分裂的能力。雖然這些細胞的功能和壽命還有待研究，但是已有明確的證據顯示，在哺乳動物的齒狀回和嗅球有成熟的神經形成。近來，隨著神經細胞群的分化研究，在脊髓區也同樣發現有成熟的神經形成。

中樞神經系統退行性疾病，遺傳性疾病等是臨床上治療的難點。由于藥物治療僅僅是對癥治療，故神經組織移植替代治療就成為最有發展前景的方法。神經元是神經系統的結構和功能單位。神經元有接受、整合和傳遞信息的功能。一般就長軸突神經元而言，樹突和胞體接受從其他神經元傳來的信息，并進行整合，然后通過軸突將信息傳遞給另一些神經元或效應器。神經干細胞(neural stemcells，NSCs)定向分化為的神經元在神經發育和修復受損神經組織中發揮重要作用。因此，尋求一種可以使NSCs定向分化為神經元的方法是國內外學者的研究熱點。但是NSCs的來源和數量有限是目前存在的主要問題。

相關研究已經證實骨髓間充質干細胞(Bone Mesenchymal Stem Cell，BMSCs)是最具有多向分化潛能和高度自我復制能力的細胞。BMSCs不僅能分化成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、肌肉細胞和造血支持細胞，還可分化為CNS細胞，包括神經元、星形膠質細胞、少突膠質細胞。BMSCs是一群存在于骨髓中的非造血干細胞。自體骨髓間充質干細胞，因具有無免疫排斥反應，取材方便，對供體損傷小，易于分離培養及體外增殖能力強的特點，因此，可為中樞神經系統疾病臨床治療提供豐富的細胞資源。

目前誘導骨髓間充質干細胞向神經元分化的方法，誘導出的神經元比例少，大部分分化成膠質細胞。因此，急需提供一種能夠提高骨髓間充質干細胞向神經元分化的誘導培養基及培養方法。

發明內容

針對現有技術中的上述不足，本發明提供了一種促進骨髓間充質干細胞向神經元分化的誘導培養基和誘導方法，可顯著提高骨髓間充質干細胞向神經元分化的誘導率。

為實現上述目的，本發明解決其技術問題所采用的技術方案是：

一種促進骨髓間充質干細胞向神經元分化的誘導培養基，包括以下組分：人參皂苷Rg11-8mg/L、三七多糖0.3-0.8mg/L、維生素C 5-12mg/L、EGF2-10μg/L、葡萄籽提取物2-5mg/L，神經元培養上清液補足。

進一步地，一種促進骨髓間充質干細胞向神經元分化的誘導培養基，包括以下組分：人參皂苷Rg16mg/L、三七多糖0.5mg/L、維生素C 7mg/L、EGF 8μg/L、葡萄籽提取物4mg/L，神經元培養上清液補足。

進一步地，三七多糖通過以下方法制備得到：取提取過三七總皂苷的廢渣，加廢渣3-5倍重量的水，煮40-60min，過濾，得第一濾液和第一沉淀，向第一沉淀中加2-4倍重量的水，煮30-50min，過濾，得第二濾液和第二沉淀，然后再向第二次沉淀中加入2-3倍水，煮20-30min，過濾，得第三次濾液和第三次沉淀，合并三次濾液，旋轉濃縮總濾液至原體積的1/4-1/5，加入無水乙醇，邊加邊攪拌，放置，然后抽濾得沉淀，再用無水乙醇洗滌沉淀，最后烘干，得三七多糖。

進一步地，葡萄籽提取物通過以下方法制備得到：

(1)將葡萄籽粉碎，加入葡萄籽重量32-35％的水和0.03-0.08％的酵母，室溫下密封發酵10-12天，然后真空干燥至含水量≤7％；

(2)以無水乙醇為萃取劑，對步驟(1)所得物進行亞臨界萃取，萃取溫度為60-62℃，萃取壓力為3.8-4.0MPa，萃取時間為1-1.5h，得萃取物；

(3)將萃取物減壓濃縮至原體積的1/3-1/4，所得濃縮液以0.6-0.8V/h的流速過活性炭柱，然后用70％乙醇溶液洗脫，最后再濃縮干燥，得葡萄籽提取物。

進一步地，神經元培養上清液通過以下方法制備得到：神經元細胞在神經元培養基中培養3-5h，換液，繼續培養3-5天，得神經元培養上清液。