[發明專利]一種礦泉水中微量大腸桿菌的檢測方法

在審

• 申請號: 201711114515.4
• 申請日: 2017-11-13
• 公開（公告）號: CN107841528A
• 公開（公告）日: 2018-03-27
• 發明（設計）人: 龍青云;李璐;尹凱欣
• 申請（專利權）人: 常州明華運輸有限公司
• 主分類號: C12Q1/66
• 分類號: C12Q1/66;C12Q1/42;C12Q1/10
• 代理公司: 北京風雅頌專利代理有限公司11403
• 代理人: 馬驍

1.一種礦泉水中微量大腸桿菌的檢測方法，其特征在于，該制備方法包括如下步驟：

將大腸桿菌菌株接種至LB培養基中，培養，離心收集菌絲，向菌絲體中加入Tris-HCl溶液，得菌絲混合液，將菌絲混合液與NaCl，EDTA按質量比2:50:1混合，置沸水浴，離心，取上清液加入NaAc，得上清液混合液，向上清液混合液中加入異丙醇，沉淀DNA，用體積分數為70%的乙醇水溶液洗滌沉淀2次，干燥，得大腸桿菌基因組DNA模板，將大腸桿菌基因組DNA模板溶于水，制成大腸桿菌基因組DNA模板水溶液；

在90~94℃條件下將大腸桿菌基因組DNA模板水溶液變性，52~55℃條件下將引物Ⅰ、引物Ⅱ、引物Ⅲ、引物Ⅳ和大腸桿菌基因組DNA模板退火，然后在70~72℃條件下將引物Ⅰ、引物Ⅱ、引物Ⅲ、引物Ⅳ延伸，此過程重復30次，得處理后大腸桿菌基因組DNA模板水溶液和處理后引物Ⅰ、引物Ⅱ、引物Ⅲ、引物Ⅳ，將處理后大腸桿菌基因組DNA模板水溶液、MgCl₂、限制性內切酶、Taq DNA 聚合酶、T4DNA 連接酶、蛋白Marker、處理后引物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ混合均勻后，得混合液，將混合液加入液體石蠟油覆蓋混合液表面，得擴增的PPK、ADK基因；

將擴增的ADK基因，插入質粒pET28a (+)中，構建重組質粒pET28a (+)-ADK，將擴增的PPK基因插入重組質粒pET28a (+)-ADK中，構建重組表達質粒pET28a(+)-PPKADK，將重組菌進行誘導表達，收集菌液，離心，取沉淀菌絲體，超聲破碎后，收集上清液，將上清液進行質量分數為12%的SDS-PAGE電泳，得電泳產物，用鎳親和層析系統對電泳產物進行純化，得洗脫液，將洗脫液用超濾膜進行超濾除鹽，得融合蛋白PPK-ADK；

（4）取融合蛋白PPK-ADK與polyP混合，得混合物A，將混合物A孵育，取孵育后混合物加入Beads-apyrase 繼續孵育，得去內源ADP融合蛋白產物；

（5）將AMP，PolyP，MgCl₂，Tris-HCl，PPK-ADK混合均勻，得微量ATP擴增反應液，將礦泉水與微量ATP擴增反應液混合，反應，得反應物，將反應物調節pH，向微量ATP擴增反應液中加入ATP，水浴，得反應液，將反應液加入生物發光反應液中，利用熒光反應，即可檢測礦泉水中微量的大腸桿菌。

2.根據權利要求1所述的礦泉水中微量大腸桿菌的檢測方法，其特征在于，所述步驟（1）中大腸桿菌菌株與LB培養基的質量比1:9，培養條件為35~37℃培養18~24h，菌絲體與Tris-HCl溶液的質量比1:10，菌絲混合液與NaCl，EDTA的質量比為2:50:1，上清液與NaAC的體積比為2:3，上清混合液與異丙醇的質量比為1:1，大腸桿菌基因組DNA模板與水的質量比為1:9。

3.根據權利要求1所述的礦泉水中微量大腸桿菌的檢測方法，其特征在于，所述步驟（2）中根據大腸桿菌 PPK、ADK基因序列和載體 pET28a (+)多克隆位點，設計引物ⅠPPK-P1 GTGTGTCATATGATGGGTCAGGAAAAGCTATA，

ⅡPPK-P2 GTGTGTGGATCCTTCAGGTTGTTCGAGTGATT，

ⅢADK-P1 GTGTGTGGATCCATG CGTATCATTCTGCTTGG，

ⅣADK-P2 GTGTGTAAGCTTTTAGCCGAGGATTTTTTCCA。

4.根據權利要求1所述的礦泉水中微量大腸桿菌的檢測方法，其特征在于，所述步驟（2）中處理后大腸桿菌基因組DNA模板水溶液、MgCl₂、限制性內切酶、Taq DNA 聚合酶、T4DNA 連接酶、蛋白Marker、處理后引物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的質量比20:3:5:6:5:12:9:9:9:9。

5.根據權利要求1所述的礦泉水中微量大腸桿菌的檢測方法，其特征在于，所述步驟（4）中融合蛋白PPK-ADK與polyP的質量比為3:1，孵育條件為35~37℃孵育10min。

6.根據權利要求1所述的礦泉水中微量大腸桿菌的檢測方法，其特征在于，所述步驟（4）中Beads-apyrase的制備：將聚胺醇與磁珠按質量比3:2混合均勻，加入反應器反應0.5~1h，得固相腺苷酸雙磷酸酶。