[發明專利]利用枯草芽孢桿菌制備D?阿洛酮糖差向異構酶的方法

在審

• 申請號: 201711106116.3
• 申請日: 2017-11-10
• 公開（公告）號: CN107699556A
• 公開（公告）日: 2018-02-16
• 發明（設計）人: 竇光朋;邵先豹;杜倩;王艷輝;李紅臣;魏巍
• 申請（專利權）人: 山東百龍創園生物科技股份有限公司
• 主分類號: C12N9/90
• 分類號: C12N9/90;C12P19/24;C12P19/02;C12R1/125
• 代理公司: 濟南金迪知識產權代理有限公司37219
• 代理人: 朱家富

技術領域

本發明涉及利用枯草芽孢桿菌制備D-阿洛酮糖差向異構酶的方法，屬于微生物技術領域。

背景技術

枯草芽孢桿菌，屬芽孢桿菌屬。革蘭氏陽性菌，單個細胞0.7～0.8×2～3微米，芽孢0.6～0.9 ×1.0～1.5微米，橢圓到柱狀，位于菌體中央或稍偏，芽孢形成后菌體不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色至淡黃色，需氧菌。

D-阿洛酮糖是一種重要的稀有糖，在自然界中極少量地存在于甘蔗糖蜜、水果干、糖制品、小麥和鼠刺屬植物中。其名稱起源于從抗菌素阿洛酮糖腺苷中也可以分離到少量的D- 阿洛酮糖。D-阿洛酮糖在人體內是通過小腸吸收進入血液循環中，在小腸吸收后不會被代謝成能量，且對于腸道微生物具有較低的發酵利用度。D-阿洛酮糖具有多種重要的生理功能：神經保護作用，將血糖、減脂，清除活性氧簇，抗氧化，抑制癌細胞增殖，低卡路里甜味劑等。

D-阿洛酮糖是D-果糖的C-3差向異構體，早期的D-阿洛酮糖合成方法是通過多級化學轉化普通單糖或非糖的前體物質，但多次的保護和脫保護操作會導致收率偏低，且合成過程繁雜，存在很大的局限性。目前，雖已有以D-果糖為原料，可通過生物轉化法制備D-阿洛酮糖的報道，但是目前已報道的微生物，產生的D-阿洛酮糖差向異構酶轉化能力仍較差，且分離純化過程較難。

中國專利文獻CN106434494A(申請號201611095535.7)公開了一株枯草芽孢桿菌及其培養方法與應用。枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)BLCY 005，2016年10月26日保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號CGMCCNo.13152。本發明還涉及該枯草芽孢桿菌的培養方法與應用。本發明首次獲得的高產D-阿洛酮糖差向異構酶的枯草芽孢桿菌BLCY-005，其發酵液中的D-阿洛酮糖差向異構酶酶活可達到143U/ml，較傳統D- 阿洛酮糖差向異構酶活提高50％以上，顯著降低生產成本，最適pH值為5.5～6.5，與傳統菌株產D-阿洛酮糖差向異構酶最適pH偏中性相比，有利于生產中對污染的控制。

萘乙酸(1-Naphthylacetic acid)，簡稱NAA，是一種有機化合物，是一種易溶于有機溶劑的無色固體。它的結構為萘的1號位置以羧甲基取代。它是植物生長調節劑中的生長素類似物，常用于商用的發根粉或發根劑中，在植物使用扦插法繁殖時使用。它也可用于植物組織培養。但目前未有用于微生物培養的相關報道。

發明內容

本發明針對現有技術的不足，提供利用枯草芽孢桿菌制備D-阿洛酮糖差向異構酶的方法，可顯著降低生產成本。

本發明的技術方案如下：

枯草芽孢桿菌制備D-阿洛酮糖差向異構酶的發酵培養基，組分如下，均為質量百分比：

玉米漿粉3～8％，葡萄糖0.8～1.5％，萘乙酸0.08～0.12％，七水硫酸鎂0.015～0.025％，磷酸氫二銨0.01～0.02％，硫酸錳0.015～0.02％，硫酸銅0.015～0.018％，氯化鐵0.08～0.12％，余量水，pH6.8～7.2。

根據本發明優選的，所述發酵培養基，組分如下，均為質量百分比：

玉米漿粉5％，葡萄糖1％，萘乙酸0.1％，七水硫酸鎂0.02％，磷酸氫二銨0.015％，硫酸錳0.018％，硫酸銅0.016％，氯化鐵0.1％，余量水，pH6.8～7.2。

利用枯草芽孢桿菌制備D-阿洛酮糖差向異構酶的方法，包括如下步驟：

(1)取枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)BLCY-005，接種于種子培養基中，進行種子培養，制得種子液；

(2)取步驟(1)制得的種子液，按照體積百分比1～2％的接種量接種于上述發酵培養基中，在溫度35～37℃、pH6.8～7.2，罐壓0.05Mpa，通風比2.0vvm，轉速250～400rpm，溶氧30％～40％的條件下，發酵培養36h，制得發酵液；

(3)取步驟(2)制得的發酵液，經離心分離、洗滌菌體，再經干燥、粉碎，制得D- 阿洛酮糖差向異構酶干粉。

根據本發明優選的，所述步驟(1)中，枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)BLCY-005來源于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號CGMCC No.13152。