[發明專利]檢測融合基因MLL/CBP的表達情況及融合型別的寡核苷酸及應用

有效

• 申請號: 201711101232.6
• 申請日: 2017-11-10
• 公開（公告）號: CN108034702B
• 公開（公告）日: 2021-09-17
• 發明（設計）人: 吳鵬飛;黃開新;王淑一
• 申請（專利權）人: 濟南艾迪康醫學檢驗中心有限公司
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686;C12Q1/6886;C12N15/11
• 代理公司: 浙江杭州金通專利事務所有限公司 33100
• 代理人: 黃素萍

本發明為檢測融合基因MLL/CBP的表達情況及融合型別的寡核苷酸及應用。先采用含有三種型別引物的多重引物熒光PCR進行初檢。若出現陽性，再用特異性引物熒光PCR進行具體型別鑒定，這樣即降低了初檢成本，又提高了檢測通量。本發明所述試劑盒特異性好，靈敏度高，通量大，適用于大批量樣本檢測。對于白血病診斷、調整治療方案、評價治療效果、預測預后、預防臨床復發都具有重要意義。

技術領域

本發明屬生命科學和生物技術領域，具體涉及一種篩查用途的白血病融合基因MLL/CBP檢測的引物、探針和檢測試劑盒。

背景技術

隨著化療、放療以及生物基因療法在治療惡性腫瘤中的廣泛應用，使大部分惡性腫瘤得以有效治療和控制，甚至部分獲得治愈。但由于化、放療在治療的同時亦會損傷正常造血干細胞及免疫細胞，導致基因突變，從而誘發治療相關性白血病(therapy-relatedleukemia)。治療相關性白血病是一種綜合癥，具有原發性白血病的各種臨床表現，主要發生于初發癌(血液惡性腫瘤、實體癌)治療后，大約占各類白血病的7％。此外，治療相關性白血病普遍存在潛伏期長，對治療反應差，生存期短的臨床特癥，嚴重危害著腫瘤患者的生存。

混合譜系白血病(Mixed-lineage leukemia,MLL)基因與其融合伙伴因染色體易位而產生的融合基因是治療相關性白血病中的常見類型，具有惡性程度高，對化療不敏感，緩解率低的特點。其中共活化集合蛋白基因(CREB,bingding protein，CBP)與MLL結合產生的融合基因MLL-CBP(t11；16)(q23；p13)是一種罕見的融合基因類型，主要有MLLexon8/CBPexon3、MLLexon9/CBPexon3和MLLexon10/CBPexon3。研究表明MLL-CBP融合蛋白能夠引發骨髓增生和加強粒性白細胞與巨噬白細胞前體自我更新和增殖能力，而這些異常現象則可能進一步發展為白血病。經臨床案例分析，MLL-CBP被證實與治療相關性急性粒單核白血病(therapy-related acute myelomonocytic leukemia,t-AMML)、慢性粒單核細胞白血病(therapy-related chronic myelomonocytic leukemia,t-CMML)等具有密切聯系，且常伴有高發性的骨髓異常增生綜合癥(therapy-related myelodysplastic syndrome,t-MDS)。

實時熒光PCR綜合生物學、酶學和熒光化學于一體，從擴增到結果分析均在封閉狀態下的PCR反應管中進行，其結果用Ct值表示，與普通PCR比較，具有特異度好，靈敏度高，操作簡單，結果更直觀等優點。實時熒光PCR中常見的方法有SYBR GreenI染料法，雙探針雜交法以及Taqman技術等。其中SYBR GreenI由于是非飽和染料，特異性不如雙探針雜交法以及Taqman法，必須通過觀察溶解曲線來判斷其特異性，而雙探針法雜交法成本又較為昂貴。因此，本試劑盒采用實時熒光PCR中的Taqman探針法檢測融合基因MLL/CBP以及對其型別進行鑒定。

發明內容

本發明設計了檢測內參/目的基因用引物、探針，采用實時熒光PCR，檢測內參基因ABL、目的基因MLL/CBP的表達情況，鑒定MLL/CBP融合型別。試劑盒通過調整內參/目的基因的引物探針比例，以及PCR反應條件，使擴增效率和速率均達到最佳。

用于MLL/CBP的檢驗試劑盒中含有紅細胞裂解液、TRIzol、氯仿、無水乙醇、ReverTra Ace qPCR RT Kit(TOYOBO公司)、檢測體系PCR反應液1、檢測體系PCR反應液2、檢測體系PCR反應液3、檢測體系PCR反應液4、陽性對照品1、陽性對照品2、陽性對照品3、陽性對照品4、陰性對照品和內參ABLPCR反應液，其特征在于：