[發明專利]CRIPSR/Cas9系統中重組sgRNA骨架載體的構建方法

有效

• 申請號: 201711081124.7
• 申請日: 2017-11-07
• 公開（公告）號: CN107937429B
• 公開（公告）日: 2021-05-14
• 發明（設計）人: 戴曉峰;高雄;孫曼曼;白仲虎
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/66
• 代理公司: 無錫盛陽專利商標事務所(普通合伙) 32227
• 代理人: 顧吉云

本發明提供了CRIPSR/Cas9系統中重組sgRNA骨架載體的構建方法，其能解決現有構建方法操作要求以及試劑配制要求較高受，普通技術人員獲得的菌株陽性率低，陽性菌株挑選費時費力的技術問題。CRIPSR/Cas9系統中重組sgRNA骨架載體的構建方法，其包括以下步驟：（1）制備線性化的sgRNA空質粒；（2）制備區分片段；（3）制備重組sgRNA骨架載體；（4）挑選重組sgRNA骨架載體；其特征在于：所述步驟（2）的區分片段包含sacB基因及其開放閱讀框（ORF）、啟動子和終止子。

技術領域

本發明涉及分子生物學和生物技術領域，特別涉及CRIPSR/Cas9系統中重組sgRNA骨架載體的構建方法。

背景技術

CRIPSR/Cas9系統，被稱為第三代基因編輯技術，廣泛應用于各類體內和體外體系的遺傳學改造、轉基因模式動物的構建，甚至基因治療領域。在利用CRIPSR/Cas9系統進行基因編輯操作時，需要選定一種sgRNA的供給形式。以對哺乳動物細胞的基因編輯為例，可使用質粒或病毒為載體表達sgRNA，也可以在體外將sgRNA生產純化出來后，直接轉染進細胞實行功能。當然，以何種形式導入sgRNA取決于實驗需要以及細胞本身的特性，但在通常情況下直接將sgRNA構建于表達載體之上更為經濟和便捷。特別是可同時表達優化的Cas9蛋白及sgRNA的All-in-one載體的出現使得研究者們能夠更加輕松的利用單個質粒實現基于CRIPSR/Cas9系統的基因編輯[Cong L, Ran FA, Cox D, Lin S, Barretto R, HabibN, Hsu PD, Wu X, Jiang W, Marraffini LA, Zhang F.Multiplex Genome Engineeringusing CRISPR/Cas-systems.Science 339,819-823(2013).]。

在sgRNA骨架載體的構建過程中，最為重要的一步是質粒的線性化。幾乎所有的sgRNA骨架載體都會利用識別位點和切割位點不一致的IIS型內切酶，使得sgRNA寡核苷酸單鏈退火配對之后能夠無縫插入。然而常用的IIS型內切酶如BsmBI等酶切效果并不充分。為解決這一問題，一些載體，例如pX330，其在使用過程中往往會在兩個反向的IIS型內切酶的酶切位點之間加入區分片段，從而可以通過膠回收的方法將線性化的載體和空質粒加以區分。盡管這一手段是有效且必要的，然而在實際操作中假陽性的產生依舊無法避免，尤其在膠回收過程中，對操作要求以及試劑配制要求較高，普通技術人員回收的線性化質粒中參雜了未充分酶切的載體，在與退火形成的具有粘性末端的sgRNA短雙鏈DNA片段進行連接后，由于殘留的少數空質粒轉化效率要遠遠超過連接產物，因而轉化大腸桿菌涂板后長出的大部分克隆都是含有空質粒的假陽性轉化子，陽性率很低，往往在10%左右，需要挑較多的單克隆進行菌落PCR鑒定才能得到陽性克隆，費時費力。

發明內容

針對上述問題，本發明提供了CRIPSR/Cas9系統中重組sgRNA骨架載體的構建方法，其能解決現有構建方法操作要求以及試劑配制要求較高受，普通技術人員獲得的菌株陽性率低，陽性菌株挑選費時費力的技術問題。

其技術方案是這樣的，CRIPSR/Cas9系統中重組sgRNA骨架載體的構建方法，其包括以下步驟：

（1）制備線性化的sgRNA空質粒，采用的sgRNA空質粒具有一對對稱的IIS型內切酶酶切位點，所述sgRNA空質粒通過IIS型內切酶進行酶切，膠回收酶切后的線性化的sgRNA空質粒；

（2）制備區分片段，所述區分片段兩端具有與IIS型內切酶酶切后對應的末端片段；

（3）制備重組sgRNA骨架載體，將步驟（1）膠回收的所述線性化的sgRNA空質粒與步驟（2）制備的區分片段連接，制備重組sgRNA骨架載體；

（4）挑選重組sgRNA骨架載體，將步驟（3）的sgRNA骨架載體轉化大腸桿菌，涂抗性平板，形成單克隆，挑單克隆用含有所述IIS型內切酶酶切位點接頭的引物進行菌落PCR鑒定；