[發明專利]CRIPSR/Cas9系統中重組sgRNA骨架載體的構建方法

有效

• 申請號: 201711081124.7
• 申請日: 2017-11-07
• 公開（公告）號: CN107937429B
• 公開（公告）日: 2021-05-14
• 發明（設計）人: 戴曉峰;高雄;孫曼曼;白仲虎
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/66
• 代理公司: 無錫盛陽專利商標事務所(普通合伙) 32227
• 代理人: 顧吉云

1.CRIPSR/Cas9系統中重組sgRNA骨架載體的構建方法，其包括以下步驟：

（1）制備線性化的sgRNA空質粒，采用的sgRNA空質粒具有一對對稱的IIS型內切酶酶切位點，所述sgRNA空質粒通過IIS型內切酶進行酶切，膠回收酶切后的線性化的sgRNA空質粒；

（2）制備區分片段，所述區分片段兩端具有與IIS型內切酶酶切后對應的末端片段；

（3）制備重組sgRNA骨架載體，將步驟（1）膠回收的所述線性化的sgRNA空質粒與步驟（2）制備的區分片段連接，制備重組sgRNA骨架載體；

（4）挑選重組sgRNA骨架載體，將步驟（3）的sgRNA骨架載體轉化大腸桿菌，涂抗性平板，形成單克隆，挑單克隆用含有所述IIS型內切酶酶切位點接頭的引物進行菌落PCR鑒定；

其特征在于：

所述步驟（2）的區分片段包含sacB基因及其開放閱讀框（ORF）、啟動子和終止子，所述sacB基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

所述步驟（2）制備區分片段，根據pK18mobSacB載體圖譜和序列設計一對含有上述IIS型內切酶酶切位點接頭的引物，該引物的擴增子應包含sacB基因的ORF及其啟動子和終止子，用該引物對pK18mobSacB載體進行PCR，獲得目的片段，膠回收PCR產物，用IIS型內切酶對其進行酶切，柱純化后得到區分片段；

所述步驟（4）還包括將PCR鑒定陽性的菌分別涂LB抗性板和含5%~10%蔗糖的LB抗性板，若在含5%~10%蔗糖的LB抗性板上無法生長而在LB抗性板上形成菌苔，則表面該菌含有構建成功的重組sgRNA骨架載體。

2.根據權利要求1所述的CRIPSR/Cas9系統中重組sgRNA骨架載體的構建方法，其特征在于：步驟（1）制備線性化的sgRNA空質粒，若已有sgRNA空質粒，則用相應的IIS型內切酶直接對其進行酶切，酶切后膠回收得到線性化的sgRNA空質粒；或者根據已構建入某sgRNA的質粒，設計引物對此質粒進行全質粒PCR，以獲取含有IIS型內切酶酶切接頭的sgRNA空質粒，隨后同樣用IIS型內切酶對其進行酶切，膠回收酶切后的線性化的sgRNA空質粒。

3.根據權利要求1所述的CRIPSR/Cas9系統中重組sgRNA骨架載體的構建方法，其特征在于：步驟（3）制備重組sgRNA骨架載體，將步驟（1）膠回收的所述線性化的sgRNA空質粒與步驟（2）制備的區分片段混勻，加入T4連接酶以及T4連接酶Buffer，置于16°金屬浴過夜連接。

4.根據權利要求1所述的CRIPSR/Cas9系統中重組sgRNA骨架載體的構建方法，其特征在于：步驟（4）挑選重組sgRNA骨架載體，將步驟（3）的連接產物轉化大腸桿菌，涂抗性平板，培養12~20小時至平板上形成單克隆，挑單克隆并用步驟（2）中所述引物進行菌落PCR鑒定，PCR鑒定陽性的菌落轉入搖瓶培養過夜，隨后進行質粒抽提，用所述IIS型內切酶酶切質粒，將酶切鑒定正確的克隆搖過夜，稀釋后分別涂LB抗性板和含5%-10%蔗糖的LB抗性板，若在含5%-10%蔗糖的LB抗性板上無法生長而在LB抗性板上形成菌苔，則表明菌中含有構建成功的重組sgRNA骨架載體。